多克隆抗體的純化方法有哪些？

日期：2025-04-09 10:59:00

常見的純化方法包括鹽析法、凝膠過濾法、離子交換層析法、親和層析法等。鹽析法是通過調(diào)節(jié)鹽濃度使抗體沉淀，初步分離抗體；凝膠過濾法根據(jù)抗體分子大小進(jìn)行分離；離子交換層析法利用抗體分子表面的電荷差異進(jìn)行純化；親和層析法是利用抗原與抗體之間的特異性結(jié)合，具有較高的純化效率和特異性，能得到高純度的抗體。

多克隆抗體的純化方法有多種，各有其特點(diǎn)和適用范圍，以下是一些常見的純化方法：

1.鹽析法

原理：通過向抗體溶液中加入中性鹽，如硫酸銨、硫酸鈉等，使蛋白質(zhì)的溶解度降低，從而沉淀析出。不同蛋白質(zhì)在不同鹽濃度下溶解度不同，借此可將抗體與其他雜蛋白分離。

操作過程：一般先將血清或細(xì)胞培養(yǎng)液等含有抗體的樣品進(jìn)行低速離心，去除雜質(zhì)。然后緩慢加入硫酸銨等鹽，邊加邊攪拌，達(dá)到一定飽和度后，抗體就會沉淀下來。經(jīng)過離心收集沉淀，再用適量的緩沖液溶解，最后通過透析或凝膠過濾等方法去除剩余的鹽。

優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)是操作簡單、成本低廉，能處理大量樣品，可用于初步純化抗體。缺點(diǎn)是純化效果相對較差，得到的抗體純度不高，通常需要結(jié)合其他方法進(jìn)一步純化。

2.凝膠過濾層析法

原理：利用具有分子篩作用的凝膠顆粒，根據(jù)分子大小對蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。當(dāng)樣品通過凝膠柱時，分子量大的蛋白質(zhì)不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，在凝膠顆粒之間的空隙中快速通過，而分子量小的蛋白質(zhì)則進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，路徑較長，從而實(shí)現(xiàn)不同大小分子的分離。

操作過程：首先選擇合適的凝膠柱，如 Sephadex G - 200、Sephacryl S - 300 等，并將其平衡至所需的緩沖液條件。然后將抗體樣品小心地加到凝膠柱頂部，用緩沖液進(jìn)行洗脫，收集不同洗脫體積的組分，通過檢測蛋白質(zhì)含量或抗體活性確定目標(biāo)抗體所在的組分。

優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)是分離效果較好，能根據(jù)分子大小有效分離抗體和其他雜質(zhì)，且對抗體的活性影響較小。缺點(diǎn)是處理量相對較小，層析柱的裝填和維護(hù)要求較高，操作時間較長。

3.離子交換層析法

原理：基于蛋白質(zhì)表面的電荷性質(zhì)和數(shù)量不同，與離子交換樹脂上的帶電基團(tuán)發(fā)生靜電相互作用而進(jìn)行分離。當(dāng)抗體溶液通過離子交換柱時，帶相反電荷的蛋白質(zhì)會結(jié)合到樹脂上，而其他電荷性質(zhì)不同的雜質(zhì)則不被吸附或吸附較弱，通過改變洗脫液的離子強(qiáng)度或 pH 值，可將結(jié)合在樹脂上的抗體洗脫下來。

操作過程：根據(jù)抗體的等電點(diǎn)選擇合適的離子交換樹脂，如 DEAE - 纖維素（陰離子交換樹脂）或 CM - 纖維素（陽離子交換樹脂）。將樹脂裝柱并平衡至合適的緩沖液條件，然后將抗體樣品上柱，用不同離子強(qiáng)度或 pH 值的緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫峰，檢測抗體活性和純度。

優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)是能有效分離不同電荷性質(zhì)的蛋白質(zhì)，純化效果較好，可通過調(diào)整洗脫條件獲得較高純度的抗體。缺點(diǎn)是需要對抗體的電荷性質(zhì)有一定了解，且洗脫條件的優(yōu)化較為復(fù)雜，可能會對抗體的活性產(chǎn)生一定影響。

4.親和層析法

原理：利用抗原與抗體之間的特異性結(jié)合作用進(jìn)行純化。將抗原或與抗體有特異性結(jié)合的配體固定在固相載體上，如瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等，當(dāng)含有抗體的樣品通過層析柱時，抗體就會特異性地結(jié)合到固定化的配體上，而其他雜質(zhì)則被洗脫除去，最后用適當(dāng)?shù)南疵撘簩⒔Y(jié)合的抗體洗脫下來。

操作過程：首先將抗原或配體通過化學(xué)方法偶聯(lián)到固相載體上，制備親和層析柱。然后將抗體樣品以適當(dāng)?shù)牧魉偻ㄟ^親和柱，使抗體與配體充分結(jié)合，用緩沖液洗去未結(jié)合的雜質(zhì)。最后用酸性或堿性洗脫液、高濃度鹽溶液等破壞抗原 - 抗體復(fù)合物，將抗體洗脫下來，立即中和洗脫液以防止抗體變性。

優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)是特異性高，能獲得純度很高的抗體，對抗體的活性保持較好。缺點(diǎn)是抗原或配體的制備和固定化過程較為復(fù)雜，成本較高，且親和柱的使用壽命有限，容易出現(xiàn)配體脫落等問題。