一、归一化为什么要归一化在得到最终的UMI计数前的每一步从捕获、逆转录到测序都会对最终结果产生影响即使两个细胞某基因的表达实际没有差异也可能在上述步骤中随机产生误差。所以要通过归一化尽可能减少抽样误差的影响有很多归一化的方法我们对其中几种进行介绍。1.常用的归一化法--文库大小归一法1.1相关概念①文库大小单个细胞所有基因计数总和即UMI计数总和。②所有细胞的平均文库大小所有细胞UMI总数的算数平均值即所有细胞的平均文库大小③大小因子Size factor):每个细胞的观测UMI总数相对于所有细胞平均UMI总数的大小。细胞UMI总数Size factor含义A20000.5文库大小为平均值的50%B40001文库大小等于平均值C60001.5文库大小为平均值的150%以上面3个细胞简单举例假设这就是样本的全部细胞所有细胞的平均文库大小200040006000÷34000A细胞的大小因子2000÷40000.5B细胞的大小因子4000÷40001C细胞的大小因子6000÷40001.51.2利用Size Factor进行归一化归一化将每个细胞的UMI总数根据比例调整到所有细胞的平均文库大小。即细胞AUMI总数2000→UMI总数4000细胞BUMI总数4000→UMI总数4000细胞CUMI总数6000→UMI总数4000gene1原先的UMI归一化后gene1的UMI细胞A612细胞B66细胞C64注意不能指望单一归一化方法适用于所有类型的scRNA-seq数据要根据特定数据集选择合适的规范化方法1.3移位对数变换—logx1 变换在常见的10x单细胞分析流程中经常存在LogNormalize处理Lognormalize文库大小归一化移位对数变化稳定方差压缩高表达计数的变化幅度减弱方差随平均表达量增加而增大的现象从而利于后续的降维和差异表达的基因的识别2.其他归一法Scran反卷积归一化Spike-in归一化SCTransform二、高变基因筛选HVGStep1计算数据中个基因的均值和方差对于每个基因计算下列两项指标①平均UMI计数了解每个基因的表达水平②UMI计数方差了解基因在细胞间的变异程度基因指标1平均UMI指标2UMI计数方差A58B100120Step2LOESS拟合均值方差趋势①因为表达量较高的基因会具有较大的方差依然先对原始的均值和方差进行对数变化②进行LOESS拟合得到拟合曲线后可以即根据某个基因的平均表达水平估计其预期方差。Step3利用预期标准差进行标准化在Step2中我们已经得到了各基因的预期方差相应地也可以得到预期标准差。接下来我们对任一细胞中的任一基因做如下变化分子某个基因在指定细胞中的原始表达量减去该基因在所有细胞中的平均原始表达量。分母预期的标准差结果zij表示第i个基因在第j个细胞中的表达值相对于该基因平均表达量的偏离程度以LOESS预测的标准差为单位。正值表示高于均值负值表示低于均值zij is the standardized value of feature i in cell j——代表第i基因中第j个细胞标准化后的表达值xij is the raw value of feature i in cell j——代表第i个基因中第j个细胞原始表达值xi is the mean raw value for feature i——代表第i个基因在所有细胞中的表达平均值si is the expected standard deviation of feature i derived from the global mean-variance fit.是LOESS预测标准差Step4计算标准化方差并进行排序4.1忽略Clipping忽略Clipping时每个基因经过下面计算得到标准化方差4.2对极高值进行clipping有些时候个别基因在个别细胞中的标准化值可能会出现极端的“离群值”如果不对这有一两个极端的细胞进行限制就会使基因的方差变得巨大。通常会人为设置标准化值的上限减少这些极端值的影响。Clipping上限设定通常将标准化值 Zij的上限设定为其中N数据集中的细胞总数如果如果某个基因的标准值超过了上限 则将其强制“截断。4.3找到高变基因最终我们找到标准化方差排名靠前的基因。排名越靠前意味着它们的实际表达变异程度远远超出了由其平均表达量所决定的理论预期。这些基因就是我们梦寐以求的高变基因Highly Variable Genes, HVGs即最有可能携带真正的生物学异质性信号低方差基因如管家基因或不表达的基因 表达量在所有细胞中几乎保持恒定这些基因不能帮助我们区分不同的细胞类型或细胞状态。高方差基因 表达量在不同细胞之间起伏剧烈。这种剧烈的波动往往对应关键的生物学差异——例如某些基因只在 T 细胞中高表达而不在 B 细胞中表达或者某些基因在细胞周期的特定阶段才被激活。