CRISPR-Cas是時(shí)下最熱門(mén)的基因編輯工具。日前，麻省總醫(yī)院（MGH）的研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了在基因組范圍內(nèi)檢測(cè)CRISPR脫靶效應(yīng)的全新方法，GUIDE-seq（Genome-wide Unbiased Indentification of DSBs Evaluated by Sequencing）。這一成果發(fā)表在十二月十六日的Nature Biotechnology雜志上。

“以往人們?cè)跈z測(cè)CRISPR-Cas核酸酶誘導(dǎo)的脫靶DNA斷裂時(shí)，往往事先假定脫靶位點(diǎn)與靶標(biāo)位點(diǎn)相似。GUIDE-seq是首個(gè)不需要這樣做的方法，而且它相當(dāng)靈敏，”這項(xiàng)研究的資深作者，哈佛醫(yī)學(xué)院的副教授J. Keith Joung說(shuō)。“這對(duì)于評(píng)估CRISPR-Cas的臨床安全性非常重要。”

CRISPR-Cas RNA引導(dǎo)性核酸酶（RGN）通過(guò)斷開(kāi)雙鏈DNA來(lái)引入遺傳學(xué)改變，RGN含有一個(gè)Cas核酸酶和一個(gè)與目標(biāo)DNA序列互補(bǔ)的短RNA。去年Joung等人首次報(bào)告，當(dāng)DNA片段與目標(biāo)片段的差異在五個(gè)核苷酸以下，CRISPR-Cas RGN就會(huì)出現(xiàn)脫靶。這樣的脫靶突變會(huì)導(dǎo)致包括癌癥在內(nèi)的副作用，鑒定并減少這些DSB是確保CRISPR臨床安全性的基礎(chǔ)。

研究人員利用一種短雙鏈寡核苷酸來(lái)標(biāo)記CRISPR-Cas誘導(dǎo)的脫靶斷裂，測(cè)序這些標(biāo)簽所在的基因組區(qū)域，就能夠確定脫靶突變的位置。研究表明，就算某個(gè)脫靶突變的出現(xiàn)頻率低至0.1%，GUIDE-seq也能夠檢測(cè)得到。由于許多脫靶突變發(fā)生在與目標(biāo)位點(diǎn)差異很大的地方，因此脫靶DSB的數(shù)量和位置是很難預(yù)測(cè)的。

現(xiàn)有工具主要是通過(guò)分析目標(biāo)序列來(lái)預(yù)測(cè)脫靶突變，研究人員將這些工具與GUIDE-seq進(jìn)行了比較。研究顯示，上述工具在預(yù)測(cè)已驗(yàn)證的脫靶位點(diǎn)時(shí)比GUIDE-seq差很多，還會(huì)錯(cuò)誤檢出實(shí)際上不被酶切的位點(diǎn)。此外，研究人員還對(duì)比了GUIDE-seq和ChIP-seq（檢測(cè)蛋白與DNA的結(jié)合），結(jié)果證明ChIP-seq并不是鑒定 CRISPR-Cas脫靶DSB的可靠方法。

GUIDE-seq也可以用來(lái)鑒定普通細(xì)胞中的DSB熱點(diǎn)區(qū)域，“之前有許多文章描述過(guò)人類(lèi)細(xì)胞的基因組脆弱位點(diǎn)，”Joung說(shuō)。“用GUIDE-seq鑒定這些位點(diǎn)，不需要事先添加藥物來(lái)增強(qiáng)斷裂。我們驚訝的發(fā)現(xiàn)，不同細(xì)胞系的DSB大多發(fā)生在不同的位置。我們的研究表明，GUIDE-seq可以成為在活細(xì)胞中研究和監(jiān)控DNA修復(fù)的有用工具。”

Joung等人之前曾經(jīng)發(fā)表文章指出，縮短引導(dǎo)RNA能夠顯著改善CRISPR-Cas的精確性，減少全基因組中的脫靶DSB。他們?cè)谶@項(xiàng)新研究中用GUIDE-seq驗(yàn)證了這個(gè)方法的有效性。

Joung希望GUIDE-seq日后可以用來(lái)鑒定其他基因編輯工具誘導(dǎo)的脫靶斷裂。他還認(rèn)為，在未形成細(xì)胞系的細(xì)胞中檢測(cè)脫靶效應(yīng)是很重要的，這樣的結(jié)果更貼近基因編輯工具在臨床上的作用機(jī)制。

“GUIDE-seq是一個(gè)非常直觀的方法，我們打算在不久的將來(lái)把分析測(cè)序數(shù)據(jù)的軟件放到網(wǎng)站上，供非商業(yè)性質(zhì)的研究人員使用，”Joung說(shuō)，他已經(jīng)為GUIDE-seq技術(shù)遞交了專(zhuān)利申請(qǐng)。