精確的DNA/基因替換，是一種很有前景的基因組編輯工具，很容易推廣到分子工程和設計育種。目前，CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠很好地作為一種工具用于植物基因敲除，例如：中國農科院用CRISPR實現(xiàn)大豆基因組編輯；安徽農科院用CRISPR編輯水稻基因；基因組編輯技術在植物基因功能鑒定及作物育種中的應用。然而，植物中的基因替換卻很少有報道。

4月1日，Nature旗下子刊《Scientific Reports》在線發(fā)表了中國農科院作物科學研究所與安徽農業(yè)大學的一項研究成果，題為“An alternative strategy for targeted gene replacement in plants using a dual-sgRNA/Cas9 design”。在這項研究中，研究人員在穩(wěn)定轉化的植物中，成功地制備了一種基因/替換系統(tǒng)，可將感興趣的基因用于目標作物的遺傳改良。本文通訊作者是中國農科院作物科學研究所的謝傳曉博士，作物科學研究所的徐云碧研究員、毛龍研究員也是本文共同作者。

用于精確的靶向基因組編輯的簡單方法，可能在植物的基因功能鑒定和遺傳改良方面有著重要的應用價值。近年來，大范圍核酸酶1、鋅指核酸酶(ZFNs)和轉錄激活因子樣效應物核酸酶(TALENs)，已被開發(fā)作為序列特異性核酸酶，用于將靶向雙鏈斷裂（DSBs）導入DNA，以讓我們通過內源性的DNA損傷修復途徑，進行基因編輯。

最近，有研究人員基于CRISPR相關核酸酶系統(tǒng)，開發(fā)出一種新的RNA引導性基因編輯工具。CRISPR/Cas9核酸酶系統(tǒng)，可以用一個嵌合RNA（一個所謂的單導向RNA，sgRNA）靶定特定的基因組位點，與蛋白質引導的靶向工具相比，具有更高程度的靶向選擇靈活性。CRISPR/Cas9系統(tǒng)已被證實能促進不同物種的基因組編輯，包括哺乳動物(包括人類)、微生物和植物。

使用CRISPR/Cas9實現(xiàn)的基因敲除，代表著這個系統(tǒng)的最早應用，因為由Cas9誘導的DSBs，可通過一種非同源末端連接(NHEJ)機制而得以修復，這是一種容易出錯的修復途徑，可能會在DNA修復過程中引入短的缺失或插入。HDR(homology-directed修復)，是修復染色體中DSBs的一種替換方法，對于植物基因組工程更有吸引力，因為它可以實現(xiàn)更微妙的DNA序列修改，包括DNA修正、靶向基因敲入或更換，或任何類型的突變。

HDR依賴性靶基因置換或敲入，為基因組編輯提供了一個前所未有的機遇，但也更有挑戰(zhàn)性，因為靶向DSB(s) 必須和一個修復模板共存?？梢酝ㄟ^使用一對TALENs或sgRNAs與Cas9核酸酶，產(chǎn)生靶向的基因組缺失突變。誘導的雙重DSB損傷或缺失突變，也是靶向基因替換的一個必備步驟。

據(jù)報道，在一種體外系統(tǒng)中，CRISPR/Cas9可在煙草(N . benthamiana)原生質體中成功實現(xiàn)HDR介導的基因替換。也有研究在玉米中利用CRISPR/Cas9，通過HDR，將一個特征基因插入到一個靶向的DSB損傷部位，并用Cas9和sgRNA表達組件共同“轟擊”DNA供體修復模板，以確保有足夠的供體拷貝出現(xiàn)在靶細胞中。粒子轟擊策略的優(yōu)點在于，可以提供許多供體模板的副本。然而，應該在后續(xù)步驟中處理目標生物中的轉換拷貝，來自載體的一部分DNA序列，可能是接收者基因組的污染物。

CRISPR/Cas9的穩(wěn)定變換，和一個包含基因組編輯必要元素的載體（通過農桿菌介導的轉化），可以通過識別“非轉基因”生物很容易地篩選出來。關于HDR介導的基因打靶，Fauser等人證明，核酸酶和切口酶系統(tǒng)都是有效的工具。當配對部位互相靠近時，精確設計相鄰配對的sgRNA/Cas9切口酶——這可能有增強特異性的優(yōu)點，可被用于靶定基因插入、基因堆疊和基因敲入。然而，迄今為止，還沒有研究在植物中創(chuàng)建體內靶向基因替換事件，同時具有較低的轉基因污染風險。

在這項研究中，研究人員通過一對sgRNAs的同時傳遞，來靶定兩個MIRs（AtMIR169a和AtMIR827a）的兩個側翼區(qū)。他們首先設計了一個雙重sgRNA/Cas9載體組合(construct# 1)，成功地刪除了miRNA基因區(qū)域——MIR169a和MIR827a。通過PCR和隨后的測序，研究人員驗證了這些缺失，從而在MIR169a和MIR827a位點分別產(chǎn)生了20%和24%的刪除效率。

然后，他們通過CRSPR/Cas9和一個DNA修復供體模板的穩(wěn)定轉換，實現(xiàn)了一個目的基因的靶向替換，其中相同的sgRNA靶位點被設計為刪除植物靶基因，并刪除促進HDR的DNA供體。這些研究結果展示了一種替代策略，使用CRSPR/Cas9系統(tǒng)，通過基因替換進行基因組編輯。