有數(shù)以百計的蛋白質(zhì)可以與RNA結(jié)合，但是弄清有哪些蛋白在哪里結(jié)合RNA，以及它們相互作用之后發(fā)生了什么，一直都是一個挑戰(zhàn)。

除了轉(zhuǎn)錄調(diào)控之外，還有更多的基因調(diào)控。隨著研究人員越來越意識到RNA所扮演的不同角色，尋找這些核酸和RNA結(jié)合蛋白(RBPs)之間的相互作用，就顯示出更大的重要性。數(shù)以百計的RBPs是已知的——其中很多涉及各種疾病，如神經(jīng)退行性變、自身免疫缺陷和癌癥，但是大部分仍有待于發(fā)現(xiàn)。發(fā)現(xiàn)RBPs結(jié)合的序列，可以闡明它們調(diào)控RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、處理以及翻譯的機(jī)制。

發(fā)現(xiàn)RBPs結(jié)合位置的最先進(jìn)的方法，依賴于核糖核蛋白復(fù)合物的交聯(lián)和免疫沉淀反應(yīng)(CLIP)，然后進(jìn)行測序。這些程序在技術(shù)上具有挑戰(zhàn)性，需要放射性，實(shí)驗(yàn)的失敗率很高，并會產(chǎn)生高百分比的重復(fù)讀取。加州大學(xué)圣地亞哥分校的Eric Van Nostrand和Gene W Yeo在一封電子郵件中說道：“當(dāng)執(zhí)行大規(guī)模CLIP實(shí)驗(yàn)作為ENCODE聯(lián)盟的一部分時，我們認(rèn)為，當(dāng)前方法沒有足夠的能力分析數(shù)以百計的因素。”他們及其同事創(chuàng)建了加強(qiáng)型的CLIP (eCLIP)，來解決這些問題。Gene W Yeo（姚偉明，音譯）是加州大學(xué)圣地亞哥分校華裔學(xué)者，其負(fù)責(zé)的科學(xué)實(shí)驗(yàn)室主要研究RNA在調(diào)節(jié)人體正常及腫瘤干細(xì)胞生物學(xué)和神經(jīng)分化方面的影響，包括計算生物基因組、建立RNA、干細(xì)胞生物學(xué)及疾病模型。

eCLIP從ChIP-seq借鑒了它的兩步多路復(fù)用庫制備技術(shù)。首先，研究人員將一個有索引的3’適配子（可允許隨后的匯集），與附著于免疫沉淀反應(yīng)珠子上的RNA片段連接起來。然后，他們通過電泳和消化掉蛋白質(zhì)，分離了復(fù)合物。在反轉(zhuǎn)錄RNA后，他們在PCR擴(kuò)增之前，將另一個包含內(nèi)聯(lián)隨機(jī)5-或10-mer的3 適配子，連接到現(xiàn)在的單鏈DNA上。

逆轉(zhuǎn)錄往往會在交聯(lián)部位終止，這可讓研究人員獲得核苷酸分辨率。在相同的順序讀取的情況中，隨機(jī)單鏈DNA適配子序列，將能夠區(qū)分來自PCR副本的獨(dú)特片段，讓后者被丟棄，從而使映射讀取的數(shù)量更為定量，并減少了浪費(fèi)的測序。此外，eCLIP為非特異性背景和固有偏誤，添加了一個大小匹配的免疫沉淀反應(yīng)前對照。

這些修改意味著，為了獲得更高比例的可用讀數(shù)并產(chǎn)生具有足夠復(fù)雜性的文庫，eCLIP需要的擴(kuò)增比其他方法少大約1000倍，以識別更混雜的RBPs所使用的序列?，F(xiàn)在，我們可以使用這些序列，來弄清RBPs如何完成它們的作用。