RNA引導的Cas9核酸酶，被廣泛用來設計各種細胞和生物的基因組。盡管Cas9能夠誘導有效的突變發(fā)生，但是脫靶效應提高了人們對于系統(tǒng)特異性的擔憂。最近，有研究人員開發(fā)出了一種 “雙切口（double-nicking）”策略，利用催化突變體Cas9D10A切口酶，將脫靶效應降至最低。4月15日，在Nature子刊《Scientific Reports》發(fā)表的一項研究中，來自英國劍橋大學和惠康基金會桑格研究所的研究人員，描述了一種基于Cas9D10A的篩查方法，將一種一體化的Cas9D10A切口酶載體與熒光激活的細胞分選富集相結合，隨后是高通量的基因型和表型克隆篩選策略，可高效地生成同基因敲除和敲入，同時具有最低的脫靶效應。

CRISPR-Cas系統(tǒng)在細菌和古細菌的適應性免疫中發(fā)揮作用，以攻擊入侵的外來遺傳因子。最近，釀膿鏈球菌2型CRISPR-Cas9系統(tǒng)，已被用來通過誘導DNA雙鏈斷裂（DSBs）進行基因組工程，DSBs可通過非同源末端連接（NHEJ）或同源引導的修復（HDR）而得以修復。誘變NHEJ能夠在修復位點誘導插入或缺失，這可能會導致開放閱讀框的移碼突變，從而產(chǎn)生截短體蛋白和在mRNA中產(chǎn)生過早成熟的停止密碼子，這是無義介導的mRNA降解的一個關鍵誘導物。

另外，HDR允許精確的基因敲入遺傳修飾，如點突變、插入和表位標記。CRISPR-Cas9系統(tǒng)可有效地生成基因組修飾，僅僅依靠一個PAM和一個與靶基因互補的sgRNA。然而，sgRNA可能經(jīng)常被設計為對靶位點有很高的特異性（在大的基因組，如哺乳動物基因組），通常相關序列包含一個或多個與sgRNA不匹配的基因，從而會產(chǎn)生潛在不良的脫靶效應。事實上，越來越多的證據(jù)表明，這樣的脫靶效應可能會影響最終實驗結果，并限制了CRISPR-Cas9的效用，特別是在臨床設置中。

最近的研究表明，CRISPR-Cas9脫靶效應可能由幾種方法誘導，包括利用縮短的sgRNAs、FokI-Cas9融合核酸酶、純化的Cas9核糖核蛋白、修改的sgRNAs或配對的催化突變Cas9切口酶。雖然這些方法當中有幾種方法能達到較低的脫靶效應，但代價是，會降低打靶效率。

有很多研究都集中在Cas9切口酶（RuvCD10A或HNHH840A），不同于野生型Cas9——會產(chǎn)生遲鈍的DSBs，它們只切割DNA的一條鏈，產(chǎn)生可被如實修復的單鏈斷裂（SSB），而不會誘導插入和缺失。為了產(chǎn)生DSBs，最近有研究開發(fā)了一種雙切口策略，包括靶定相鄰區(qū)域的配對切口酶，從而意味著脫靶DSBs的可能性減至了最小化。然而，多個質(zhì)粒的共轉讓，包括一個Cas9切口酶、兩個sgRNA和一個熒光標記，可能會影響轉染效率和定向誘變，因此，到目前為止，這種方法的廣泛使用受到了限制。

在這項研究中，研究人員描述了一種基于Cas9D10A的篩查方法，將一種一體化的Cas9D10A切口酶載體與熒光激活的細胞分選富集結合，隨后是高通量的基因型和表型克隆篩選策略，可高效地生成同基因敲除和敲入，同時具有最低的脫靶效應。研究人員在三種不同的人細胞系中，通過靶定DNA損傷反應（DDR）蛋白MDC1、53BP1、RIF1和P53，以及核架構蛋白Lamin A/C的基因，驗證了這種方法。

研究人員還利用單鏈寡脫氧核苷酸作為同源模板，有效地獲得了雙等位基因敲入克隆，在RIF1位點插入了一個EcoRI識別位點，并在組蛋白H2AFX位點引入一個點突變，以抑制DDR因子在DNA雙鏈斷裂位點的組裝。這種通用的篩查方法，應該有助于旨在確定基因功能、模擬癌癥和其他疾病的研究，并探索新的治療機會。