在4月21日的《自然實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》（Nature Protocols）雜志上，清華大學(xué)的朱聽(tīng)（Ting Zhu）研究員與博士生姜文君（Wenjun Jiang）撰文，詳細(xì)介紹了利用一種叫做Cas9輔助靶向染色體片段（CATCH）的方法，靶向分離及克隆100kb微生物基因組序列的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案。

朱聽(tīng)研究員的主要研究方向包括合成生物學(xué)、人造細(xì)胞；新一代高通量DNA測(cè)序、宏基因組學(xué)；高通量DNA測(cè)序在癌癥和傳染病等疾病領(lǐng)域中的應(yīng)用；生命的起源、遠(yuǎn)古生命與極端條件下生命體的發(fā)現(xiàn)與測(cè)序。

隨著各種微生物基因組測(cè)序工作的不斷完成和序列信息的大量累積，微生物基因組研究的重點(diǎn)已從結(jié)構(gòu)基因組學(xué)轉(zhuǎn)為功能基因組學(xué)，大量未知功能的基因和基因簇有待大家去解析。在細(xì)菌的基因組中，功能密切相關(guān)的基因常聚集在一起，形成一個(gè)大的基因簇或操控子。很多細(xì)菌的基因組中存在基因組島，與細(xì)菌的毒力、耐藥等密切相關(guān)，它們常作為一個(gè)整體在細(xì)菌之間進(jìn)行轉(zhuǎn)移。要分析基因簇或基因組島這些長(zhǎng)基因組序列的功能，需要對(duì)整個(gè)基因簇或基因組島進(jìn)行遺傳操作。

DNA克隆是基因功能研究中最為基礎(chǔ)和關(guān)鍵的內(nèi)容。目前，PCR是DNA克隆中最常用的方法。但該方法可在產(chǎn)物中引入突變，并且隨著PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度的增加，突變率也增加。另一個(gè)獲得長(zhǎng)基因組序列的途徑就是采用限制性酶來(lái)消化基因組DNA。然而，作為一種非靶向性方法，從大量的限制性消化產(chǎn)物中挑出特異的目的序列非常具有挑戰(zhàn)且麻煩。因此，常用傳統(tǒng)PCR或限制性酶消化通常難于直接獲得這樣的長(zhǎng)基因組序列，克隆這些序列仍然是分子生物學(xué)中一個(gè)技術(shù)障礙。

在2015年9月的Nature Communications雜志上，朱聽(tīng)研究員與特拉維夫大學(xué)的Yuval Ebenstein，以及中科院微生物研究所的婁春波研究員合作，報(bào)告稱他們開(kāi)發(fā)出了一種叫做CATCH的方法，其能夠一步靶向克隆幾乎任意的、長(zhǎng)達(dá)100kb的長(zhǎng)細(xì)菌基因組序列。在體外借助于RNA引導(dǎo)的Cas9核酸酶在兩個(gè)指定位點(diǎn)從細(xì)菌染色體中切下目標(biāo)基因組片段，然后通過(guò)Gibson組裝將其連接到克隆載體中。這一技術(shù)可成為目標(biāo)克隆大基因簇一種有效的分子工具。

在這篇Nature Protocols文章中，作者們描述了CATCH克隆方法的一種優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案。這一實(shí)驗(yàn)方案采用的是標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備，僅需在幾天內(nèi)經(jīng)歷約8小時(shí)的實(shí)驗(yàn)時(shí)間，它有潛力簡(jiǎn)化及加速?gòu)奈⑸镏蟹蛛x及克隆大基因簇的研究工作。

所有的分子生物學(xué)家都會(huì)告訴你：將DNA片段克隆到載體中去是一件棘手的事情。研究人員要查看復(fù)雜的限制性酶切圖譜，費(fèi)盡心力找到適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶組合，然后熬過(guò)漫長(zhǎng)的連接和轉(zhuǎn)化過(guò)程，希望能夠生成少數(shù)正確插入的克隆。那如果能夠擺脫所有這些繁瑣的步驟，在任意位點(diǎn)切割質(zhì)粒，然后無(wú)縫插入你的靶DNA，會(huì)怎么樣呢？南佛羅里達(dá)大學(xué)Morsani醫(yī)學(xué)院變態(tài)反應(yīng)和免疫學(xué)部的研究人員轉(zhuǎn)向了基因組工程系統(tǒng)——CRISPR/Cas9，開(kāi)發(fā)出了體外“CRISPR克隆”法。

來(lái)自荷蘭Hubrecht研究所和烏特勒支醫(yī)學(xué)中心（UMC Utrecht）、麻省理工學(xué)院的研究人員稱，他們開(kāi)發(fā)出了一種自身克隆CRISPR/Cas9(scCRISPR)技術(shù)，可以繞開(kāi)基因編輯過(guò)程中所有的克隆步驟，在數(shù)小時(shí)內(nèi)完成CRISPR/Cas9介導(dǎo)基因突變及位點(diǎn)特異性轉(zhuǎn)基因敲入。他們的研究成果發(fā)布在2015年10月29日的《Stem Cell Reports》雜志上。