基因編輯，尤其是CRISPR/Cas9系統(tǒng)，從某種意義上來(lái)說(shuō)就像是一輛正在生產(chǎn)的閃亮新車(chē)，在構(gòu)建主要框架的同時(shí)也開(kāi)始啟動(dòng)，而且還準(zhǔn)備開(kāi)始一路飚車(chē)。

自2012年底CRISPR/Cas9最初被用于基因編輯之后，這個(gè)前途光明的技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用到了許多研究領(lǐng)域，而且隨著技術(shù)的改良，越來(lái)越多的研究團(tuán)隊(duì)利用CRISPR進(jìn)行大規(guī)模的遺傳篩選，比如用于識(shí)別導(dǎo)致癌癥抵抗治療的突變，或者加速藥物靶標(biāo)評(píng)估。RNA干擾，相比于CRISPR/Cas9 在遺傳篩選方面的作用，無(wú)論是效率和特異性方面，目前都難以望其項(xiàng)背了。

同時(shí)，譬如MD安德森癌癥中心等處的研究人員也開(kāi)始進(jìn)一步了解CRISPR/Cas9的特性和局限性，了解它到底能做些什么，比如分析人類(lèi)細(xì)胞系。CRISPR/Cas9 工具箱不斷的擴(kuò)大，Broad研究院的張鋒等人也開(kāi)始利用Cas9結(jié)合到基因組上，停止或者加強(qiáng)轉(zhuǎn)錄。他們對(duì)于CRISPR/Cas9在遺傳篩選方面的作用，有何看法呢？

張鋒研究組曾在“Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity”這篇文章中，探討了從化膿性鏈球菌中改變了組成Cas9酶的1400個(gè)氨基酸中的3個(gè)氨基酸，從而將基因編輯中脫靶效應(yīng)降低到了幾乎無(wú)法檢測(cè)的水平的可能性。當(dāng)RNA 與DNA 不是那么配對(duì)的時(shí)候，Cas9內(nèi)切酶會(huì)誘導(dǎo)脫靶突變，導(dǎo)致這無(wú)法成為臨床試驗(yàn)中的精確基因編輯。

為了能容納下Cas9蛋白，DNA鏈需要分開(kāi)，張鋒研究組進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)在Cas9蛋白位點(diǎn)的負(fù)電荷非靶標(biāo)DNA上有一個(gè)合適的正電荷凹槽。“我們認(rèn)為如果能中和部分正電荷，就能消弱穩(wěn)定性，從而能Cas9更具特異性，”張鋒說(shuō)。

他們利用已知定位在特殊脫靶位點(diǎn)上的導(dǎo)向RNAs來(lái)進(jìn)行了這個(gè)方法的實(shí)驗(yàn)，研究組構(gòu)建出了Cas9的32個(gè)單突變，然后將每個(gè)突變通過(guò)EMX1基因有效，但容易出現(xiàn)錯(cuò)誤的導(dǎo)向RNA，靶向EMX1。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中五個(gè)能完成EMX1基因的基因編輯，但是會(huì)十倍比率的減少脫靶位點(diǎn)的切割，之后研究人員又嘗試?yán)?span lang="EN-US">Cas9突變?nèi)デ袛嗔硗庖粋€(gè)基因：VEGFA，這種基因已知能在兩個(gè)之前識(shí)別的脫靶位點(diǎn)上進(jìn)行切割。雖然所有的Cas9突變都減少了脫靶效應(yīng)，但是研究人員認(rèn)為他們應(yīng)該結(jié)合這些突變，讓Cas9更加特異性。因此他們利用三點(diǎn)突變體（triple-point mutations）產(chǎn)生了兩個(gè)不同的突變，發(fā)現(xiàn)“我們能完成靶向激活，并進(jìn)一步減少脫靶活性，”張鋒說(shuō)。