最近，有研究報(bào)道CRISPR-Cas9系統(tǒng)能夠靶定病毒RNA，因此這種現(xiàn)象提出了一個(gè)有趣的問(wèn)題：Cas9是否也可能影響細(xì)胞mRNAs的翻譯。7月13日，來(lái)自深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院的研究人員，在Nature子刊《Scientific Reports》上發(fā)表題為“Targeting cellular mRNAs translation by CRISPR-Cas9”的研究成果，對(duì)這個(gè)問(wèn)題進(jìn)行了探討。

這項(xiàng)研究的通訊作者是深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室副研究員黃衛(wèi)人，其2009年畢業(yè)于中山大學(xué)，北京大學(xué)博士后，主要從事泌尿生殖系統(tǒng)疾病發(fā)生機(jī)制、腫瘤免疫細(xì)胞治療，合成生物學(xué)腫瘤治療、個(gè)體化診斷及治療研究。承擔(dān)國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究計(jì)劃（973）、國(guó)家高新技術(shù)發(fā)展計(jì)劃（863）、國(guó)家自然科學(xué)基金、中國(guó)博士后基金、廣東省自然科學(xué)基金、深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目等多個(gè)項(xiàng)目，以第一作者或者通訊作者在Nature Communications等雜志發(fā)表SCI論文10多篇，申報(bào)國(guó)家發(fā)明專利8項(xiàng)。

細(xì)菌II型CRISPR-Cas9系統(tǒng)是基礎(chǔ)生物學(xué)和生物工程中一種新興的多功能工具。Cas9內(nèi)切酶可以通過(guò)一條向?qū)?/span>RNA（sgRNA），靶定和切割含有PAM的雙鏈DNA。DNA打靶的特異性是由sgRNA-DNA堿基配對(duì)和PAM序列決定的。CRISPR-Cas9通常被重新編程為介導(dǎo)原核和真核系統(tǒng)中的基因組修飾，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)學(xué)上具有很好的應(yīng)用。核酸酶缺陷的Cas9與轉(zhuǎn)錄激活因子或抑制因子融合，能在基因組范圍內(nèi)激活或抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)呈現(xiàn)PAM的寡核苷酸作為單條DNA出現(xiàn)時(shí)，Cas9也可以切割單鏈DNA / RNA靶標(biāo)。盡管在基因組編輯和基因調(diào)控領(lǐng)域引起了廣泛的興趣，但是這項(xiàng)技術(shù)還是受到脫靶效應(yīng)這些問(wèn)題的限制。目前，根據(jù)深度測(cè)序的結(jié)果，研究人正在開發(fā)減少這些影響的具體策略。

與CRISPR-Cas9誘導(dǎo)的 DNA干擾相反，傳統(tǒng)的技術(shù)——包括反義RNA、核酶和RNA干擾，會(huì)在mRNA水平影響基因的表達(dá)。反義RNA通過(guò)Watson-Crick堿基配對(duì)，直接抑制互補(bǔ)mRNA的翻譯。在設(shè)計(jì)一種重編程核酶的時(shí)候，一段引導(dǎo)序列被用來(lái)與靶mRNA雜交，并引導(dǎo)核酶的特異性裂解。小干擾RNA，如siRNA、shRNA，可通過(guò)指導(dǎo)RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC）結(jié)合并降解mRNA，而介導(dǎo)基因沉默。基于這些觀察結(jié)果——mRNA靶標(biāo)可結(jié)合一段與mRNA互補(bǔ)的單獨(dú)序列，sgRNA也有一段反義序列，科學(xué)家們想知道，sgRNA-Cas9復(fù)合物是否影響mRNA的穩(wěn)定性和翻譯。雖然其他CRISPR-Cas系統(tǒng)的sgRNA能靶定RNA，但是Cas9被認(rèn)為不能切割沒(méi)有單獨(dú)PAM呈現(xiàn)寡核苷酸存在的RNA。

直到最近，有研究報(bào)道，sgRNA-Cas9復(fù)合物可以不依賴于PAM而與丙型肝炎病毒（HCV）的RNA結(jié)合，并抑制病毒蛋白的生產(chǎn)。雖然真核核糖體可以翻譯細(xì)胞的mRNA和病毒RNA，但其翻譯起始的機(jī)制是完全不同的。HCV RNA的翻譯是由內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）介導(dǎo)的，而細(xì)胞mRNA的翻譯是由含有多個(gè)起始因子的5′-帽結(jié)構(gòu)觸發(fā)的。因此，目前還不清楚的是，當(dāng)不存在攜帶PAM的DNA時(shí)，sgRNA-Cas9復(fù)合物是否影響細(xì)胞基因的mRNA翻譯。

在這項(xiàng)研究中，研究人員表明，自然和催化失活的Cas9可以抑制細(xì)胞基因的mRNA翻譯，sgRNA 5’端的第一個(gè)14nt，對(duì)于這個(gè)過(guò)程是必不可少的。CRISPR-Cas9可以抑制一個(gè)意想不到的靶基因的蛋白表達(dá)，而不影響其DNA序列，也不會(huì)造成意想不到的表型變化。利用設(shè)計(jì)的RNA適配子-配體復(fù)合物——它會(huì)阻礙翻譯機(jī)器，研究人員表明，障礙機(jī)制是引起這一現(xiàn)象的原因。這項(xiàng)研究表明，Cas9研究應(yīng)該通過(guò)在DNA和蛋白質(zhì)水平上檢測(cè)基因的變化，而避免潛在的脫靶效應(yīng)。