來自湖北省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所、河南科技大學(xué)和中科院水生生物研究所的研究人員，用CRISPR/Cas9系統(tǒng)和Cre/LoxP，敲除了豬初生細(xì)胞中肌生成抑制蛋白（MSTN）的一個(gè)等位基因，制備了無選擇標(biāo)記的MSTN基因敲除克隆豬。相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在8月17日的《Scientific Reports》雜志。湖北省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所的鄭新民研究員和河南科技大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院的董發(fā)明教授，是本文共同通訊作者。

可預(yù)測的、無污染的轉(zhuǎn)基因家畜，對于可靠的表型和生物安全，都是很重要的。因?yàn)椴幌胍男蛄械囊?，?/span>SMGs（選擇標(biāo)記基因），已經(jīng)引起了公眾對于食品安全、生物多樣性和農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的強(qiáng)烈擔(dān)憂。SMGs經(jīng)常用于細(xì)胞介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因，使我們能夠分離出轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。但是一旦操作完成，它們在從這些細(xì)胞制備而來的GM家畜中，就沒有任何價(jià)值，相反，殘留在家畜中的SMGs還可能成為一種負(fù)擔(dān)。

有幾種方法可以用來制備無SMG的轉(zhuǎn)基因家畜。然而，到目前為止，這些方法固有的技術(shù)局限性，阻礙了無污染轉(zhuǎn)基因方法的常規(guī)使用。例如，將一個(gè)表達(dá)組件直接顯微注射到受精卵中，可避免任何SMG的使用，但是效率非常低、隨機(jī)整合并存在潛在的嵌合現(xiàn)象，從而導(dǎo)致這種方法是不切實(shí)際和昂貴的。相反，傳遞mRNA或編碼蛋白質(zhì)的可編程核酸酶（如CRISPR/Cas9），已被證明是制備無SMG轉(zhuǎn)基因家畜的一種有效策略。

Cre/LoxP重組系統(tǒng)被廣泛用于轉(zhuǎn)基因小鼠，用以組織特異性的基因打靶以及基因切除。然而，Cre/LoxP在轉(zhuǎn)基因家畜中仍未得以很好的研究，只有少數(shù)研究描述了它在大型動(dòng)物中的效用。

在這項(xiàng)研究中，研究人員通過CRISPR/Cas9和Cre/LoxP制備了無SMG的功能性MSTN（肌生成抑制蛋白）基因敲除克隆豬。他們利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的同源重組（HR），來敲除豬初生細(xì)胞中MSTN的一個(gè)等位基因。然后，用Cre重組酶來切除SMG，有效率為82.7%。研究人員通過流式細(xì)胞儀分離出了無SMG的非EGFP細(xì)胞，并被立即用作供體細(xì)胞核用以核移植。分子測試在這項(xiàng)克隆豬中驗(yàn)證了單等位基因MSTN KO和SMG刪除。免疫印跡顯示，在MSTN中大約有50%的降低，同時(shí)肌原性基因在肌肉中的表達(dá)有所增加。組織學(xué)檢查顯示，肌纖維數(shù)量增加，但是肌纖維大小保持不變。超聲波檢測顯示，最長肌大小增加，背脂肪厚度降低。豬MSTN基因的精密編輯，產(chǎn)生了無SMG的MSTN KO克隆豬，提供了一種可靠的途徑用于家畜良種生產(chǎn)，也提出了一種策略來減少潛在的生物學(xué)風(fēng)險(xiǎn)。

另外在今年6月，Nature子刊《Scientific Reports》在線刊登了同濟(jì)大學(xué)、中科院上海生命科學(xué)研究院、上海交通大學(xué)以及加州大學(xué)洛杉磯分校的一項(xiàng)研究成果。在這項(xiàng)研究中，研究人員用CRISPR技術(shù)制備了一組Lep突變大鼠，它們在成熟LEP蛋白中攜帶14th Ile (LEP∆I14)無效突變或者缺失。

肌生成抑制蛋白（Mstn）是哺乳動(dòng)物骨骼肌質(zhì)量的一個(gè)保守的負(fù)調(diào)節(jié)因子。然而，在家畜中是否能夠?qū)崿F(xiàn)Mstn的精確敲除，能否被安全地用來提高產(chǎn)肉性能，尚未得到證實(shí)。近期，來自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)、斯坦福大學(xué)等處的研究人員，在Nature子刊《Scientific Reports》發(fā)表題為“Generation and evaluation of Myostatin knock-out rabbits and goats using CRISPR/Cas9 system”的研究成果，該研究利用CRISPR/Cas9來制備Mstn基因敲除家兔和山羊，然后分析了它們的表型變化，對上述問題進(jìn)行了探討。

到目前為止，密切模擬人類病理和行為缺陷的神經(jīng)系統(tǒng)疾病猴模型，還沒有被成功地制備出來。8月9日，國際學(xué)術(shù)期刊《Cell Research》在線刊登了我國科學(xué)家的一項(xiàng)重要研究成果，這項(xiàng)研究采用TALEN技術(shù)，制備了小頭畸形致病基因MCPH1突變體食蟹猴模型，并對這種MCPH猴模型的表型進(jìn)行了描述。