控制基因表達(dá)水平的能力，是生物學(xué)中的一個主要任務(wù)。一種廣泛使用的方法是刪除一個感興趣的非必須基因（Knockout），或者多步重組讓一個感興趣的基因表達(dá)減少（Knockdown）。然而，這些遺傳學(xué)方法是費(fèi)時費(fèi)力的，并且對于定量研究來說是有限的。12月20日，在Nature子刊《Scientific Reports》發(fā)表的一項(xiàng)研究中，來自加州大學(xué)圣地亞哥分校的研究人員，報(bào)道了一種可調(diào)的CRISPR-cas系統(tǒng)——tCRISPRi，用于基因表達(dá)的精確和連續(xù)的滴定測量。

CRISPR-Cas是原核生物中RNA介導(dǎo)的一種免疫系統(tǒng)，它是由CRISPR和CRISPR相關(guān)蛋白Cas組成的。根據(jù)它們的進(jìn)化關(guān)系主要有三種類型的CRISPR-Cas系統(tǒng)。在化膿性鏈球菌II型CRISPR-Cas系統(tǒng)中，大的單蛋白Cas9 具有RuvC樣和HNH核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)靶DNA的切割以引起雙鏈斷裂。在HNH和RuvC樣核酸酶結(jié)構(gòu)域具有突變的核酸酶缺陷型Cas9（dcas9），不能切割DNA。相反，dCas9可緊密結(jié)合靶DNA，從而影響轉(zhuǎn)錄。dcas9可以瞬時或穩(wěn)定地控制基因表達(dá)的水平，而不改變基因序列本身。最近開發(fā)的一種合成系統(tǒng)，可在體內(nèi)減少RNA的加工步驟。Cas9的這些特性使其成為CRISPR介導(dǎo)的干擾 (CRISPRi) 的一種有力的工具。

同時，CRISPR Cas9用于基因組DNA編輯和基因調(diào)控的精度和通用性是強(qiáng)大的，許多CRISPR Cas9系統(tǒng)被Cas9的組成型表達(dá)引起的毒性所阻礙。原則上，這個問題可以通過在一個理想的可誘導(dǎo)和可調(diào)節(jié)的啟動子下表達(dá)Cas9而得以解決。這將允許我們以一種劑量依賴性的模式，對Cas9的表達(dá)水平進(jìn)行精確調(diào)控。不幸的是，許多常用的細(xì)菌誘導(dǎo)型啟動子所起的作用是“開/關(guān)”開關(guān)，并缺乏一個變阻器樣的功能來允許這種可調(diào)的基因表達(dá)。最近，有研究人員在一個木糖誘導(dǎo)型啟動子下表達(dá)了dcas9，來敲除枯草芽孢桿菌中的必需基因，并基于功能分析表征了必需基因的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

將CRISPR -(d)Cas9系統(tǒng)用于高通量實(shí)驗(yàn)的另一個實(shí)際問題是，構(gòu)建sgRNA用于靶定新基因的過程是費(fèi)時費(fèi)力的。目前用于sgRNA構(gòu)建的方法主要依靠基于質(zhì)粒的分子克隆技術(shù)，其次是轉(zhuǎn)化。然而，質(zhì)粒通常存在于多個副本中，因此當(dāng)需要精確量化時它們就不太理想。質(zhì)粒也含有自己的基因，并需要通過藥物選擇得以維持。因此，多拷貝質(zhì)粒為基礎(chǔ)的系統(tǒng)可能會抑制一般細(xì)胞的生長和基因表達(dá)，并且對細(xì)胞生理產(chǎn)生顯著影響。

在這項(xiàng)研究中，研究人員開發(fā)了一種可調(diào)的CRISPRi (“tCRISPRi”)，它可以對大多數(shù)的必需和非必需基因?qū)崿F(xiàn)30倍的抑制。研究人員還設(shè)計(jì)了細(xì)菌基因組，這樣PBAD啟動子就能夠以一種劑量依賴性系統(tǒng)被阿拉伯糖誘導(dǎo)，而在缺乏阿拉伯糖的情況下沒有表現(xiàn)出最小泄漏的雙峰表達(dá)。根據(jù)外部添加的阿拉伯糖，dCas9的表達(dá)是以一種線性的方式進(jìn)行回應(yīng)。重要的是，這個品系只需要一個單鏈寡核苷酸重組步驟，就可以將想得到的sgRNA插入到染色體，以允許它的組成型表達(dá)。

這些結(jié)果表明，tCRISPRi與重組相結(jié)合，為基因表達(dá)的控制提供了一種簡單和易于操作的工具，并且非常適合于單個sgRNA和高通量可調(diào)的knockdown文庫的構(gòu)建。