因在CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)方面獲得重大突破而聲名鵲起的Jennifer Doudna雖然在CRISPR專利案中暫時(shí)失利（CRISPR專利最新消息：張鋒贏了)，但研究組成果不斷，繼去年年底開發(fā)了兩套新型的CRISPR-Cas基因編輯系統(tǒng)，命名為CRISPR-CasX 和CRISPR-CasY之后，最近又在小鼠大腦中完成了有效的基因組編輯，為CRISPR-Cas9在神經(jīng)細(xì)胞疾病中的應(yīng)用再添一把火。

這項(xiàng)最新研究公布在2月13日的Nature Biotechnology雜志上。

Cas9是一種由RNA導(dǎo)向的DNA結(jié)合和切割蛋白，能用于多種生物中，進(jìn)行基因和非編碼遺傳元件的編輯修飾。目前Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用到了眼、耳、肝和肌肉相關(guān)疾病的治療中，但是組織特異性傳遞不理想依然是一個(gè)問題，這主要是因?yàn)閹追矫娴脑?，如直接整合到基因組DNA上，由細(xì)菌Cas9蛋白在編輯細(xì)胞中的持續(xù)表達(dá)引起的免疫應(yīng)答和脫靶編輯。

一種解決方法就是利用非遺傳編碼，預(yù)組裝和短壽命的Cas9核糖核蛋白（RNP）復(fù)合物，在最新這篇文章中，研究人員為了檢測(cè)體內(nèi)Cas9 RNP的活性，首先對(duì)Ai9 tdTomato小鼠進(jìn)行了改進(jìn)，這種報(bào)告小鼠模型能提供位點(diǎn)特異性基因組編輯的高通量和定量序列讀取，這種位點(diǎn)特異性基因組能令基因修飾細(xì)胞中的紅色熒光蛋白獲得功能信號(hào)。

研究人員研發(fā)出了一種單導(dǎo)向sgRNA，他們將其稱為 sgRNAtdTom ，sgRNAtdTom能去除終止盒，激活細(xì)胞中的tdTomato表達(dá)。之后他們利用這種sgRNAtdTom RNP復(fù)合物對(duì)神經(jīng)祖細(xì)胞（NPC）進(jìn)行核轉(zhuǎn)染后，通過顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)分析，研究人員觀察到了一種RNP劑量依賴性激活，同時(shí)基因位點(diǎn)的NGS序列分析也表明Cas9 RNP誘導(dǎo)出現(xiàn)了插入或者缺失突變。

這些一系列的研究發(fā)現(xiàn)表明盡管tdTomato+細(xì)胞的數(shù)目低于報(bào)道過的RNP總基因編輯數(shù)量，但是tdTomato小鼠可以用于肉眼檢測(cè)Cas9 RNP基因組編輯，并且可以在體內(nèi)觀察到編輯細(xì)胞。

通過這項(xiàng)研究，Doudna等人證實(shí)了在成體小鼠海馬，紋狀體和皮層中注射Cas9核糖核蛋白（RNP）復(fù)合物，能完成小鼠大腦的有絲分裂后神經(jīng)元的基因編輯，而且多個(gè)SV40核定位序列的Cas9編輯能將體內(nèi)神經(jīng)元編輯的效率提高十倍。

作者表示，這些研究成果證明了Cas9 RNP介導(dǎo)的神經(jīng)祖細(xì)胞基因組編輯可以用于體外，以及體內(nèi)多個(gè)不同的大腦區(qū)域，雖然目前還不清楚4×NLS-Cas9-2×NLS RNP體內(nèi)親神經(jīng)性（neurotropism）的具體機(jī)制，但是這可以用于神經(jīng)元特異性靶向。由此說明這一技術(shù)未來可以用于治療不同神經(jīng)元的遺傳神經(jīng)系統(tǒng)疾病，糾正或滅活大腦神經(jīng)系統(tǒng)疾病的潛在遺傳因素。此外，研究也表明功能性Cas9 RNP可以以以非遺傳編碼方式，有效，精確和安全的遞送到成體動(dòng)物大腦的神經(jīng)元上，解決了前文提出的問題，有助于未來利用Cas9-RNP復(fù)合物治療神經(jīng)性疾病，以及用于一般的組織特異性基因編輯。

Doudna致力于探討了CRISPR-Cas9在各方面的應(yīng)用，此前她也曾在Cell上發(fā)表綜述，指出CRISPR-Cas9在醫(yī)療領(lǐng)域有著廣闊的前景，可以用來矯正致病突變，治療人類疾病。研究者們也在嘗試用這一技術(shù)操縱生態(tài)群體，比如根據(jù)毒力或者抗性基因殺死相應(yīng)的細(xì)菌、快速改變種群性狀、控制入侵物種、改良主要農(nóng)作物等等。這一技術(shù)將帶領(lǐng)生物學(xué)研究進(jìn)入一個(gè)新的時(shí)代。