自二十世紀(jì)九十年代中期以來(lái)，芯片就一直是基因組表達(dá)分析的中堅(jiān)力量。在這一技術(shù)最輝煌的時(shí)期，準(zhǔn)備研究基因表達(dá)模式的人都會(huì)想到使用芯片。不過(guò)隨著測(cè)序成本的直線下降，RNA測(cè)序（RNA-seq）成為了越來(lái)越受歡迎的轉(zhuǎn)錄組分析方法。

 

DNA芯片上排列著大量的核酸探針，可以代表生物的整個(gè)基因組或部分基因組，比如外顯子、miRNA、單核苷酸多態(tài)性SNP等等。用芯片分析基因表達(dá)需要抽提RNA，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行熒光標(biāo)記。芯片上各點(diǎn)的信號(hào)強(qiáng)弱，代表了該探針目的基因的表達(dá)量。

 

RNA-seq主要是將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA文庫(kù)，然后進(jìn)行直接測(cè)序。雖然處理原始數(shù)據(jù)比較麻煩，但RNA-seq能夠做得到芯片做不到的事。RNA-seq可以揭示未知的轉(zhuǎn)錄本、基因融合和遺傳多態(tài)性，而芯片只能檢出明確的已知目標(biāo)。在測(cè)序深度足夠的情況下，RNA-seq在高豐度和低豐度轉(zhuǎn)錄本檢測(cè)中都比芯片有效。

 

不過(guò)由于芯片可以快速分析大量樣本，該技術(shù)在這方面還將繼續(xù)占據(jù)統(tǒng)治地位，FDA國(guó)家毒理學(xué)研究中心的Weida Tong指出。不過(guò)，科學(xué)研究最終將完全轉(zhuǎn)向RNA-seq，Tong說(shuō)。在此之前，芯片和RNA-seq數(shù)據(jù)應(yīng)當(dāng)更加兼容，RNA-seq數(shù)據(jù)的分析和儲(chǔ)存必須進(jìn)一步簡(jiǎn)化。“這就像是臨產(chǎn)前的陣痛期，”Tong說(shuō)。“一旦完成這個(gè)痛苦的過(guò)程，大家就能真正享受到技術(shù)帶來(lái)的福利。”

 

The Scientist雜志與多位專家共同探討了從芯片到RNA-seq的過(guò)渡，希望幫助研究者們順利度過(guò)這段艱難的轉(zhuǎn)型期，最終實(shí)現(xiàn)華麗轉(zhuǎn)身。

 

通向全新世界

 

芯片分析依賴于已知的基因組信息，這也是該技術(shù)的最大局限。顯然，在探索性研究和非模式生物研究中，RNA-seq才是真正的大贏家。RNA-seq的轉(zhuǎn)錄組分析是無(wú)偏好的，可以揭示新剪接點(diǎn)、小RNA以及芯片漏掉的新基因。

 

“與芯片探針不同，RNA測(cè)序不需要預(yù)先知道序列信息，”安捷倫科技公司的Kevin Poon說(shuō)，“因此它是一個(gè)理想的研發(fā)平臺(tái)，能夠獲得轉(zhuǎn)錄本序列并在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)突變和融合轉(zhuǎn)錄本。”

 

改用RNA-seq的研究者們往往是“看到了芯片無(wú)法檢出的生物學(xué)信息，”賽默飛世爾公司的Anup Parikh指出。舉例來(lái)說(shuō)，南佛羅里達(dá)大學(xué)（USF）Christina Richards實(shí)驗(yàn)室的研究生Mariano Alvarez正在研究2010墨西哥灣漏油事件對(duì)當(dāng)?shù)刂参锏挠绊憽Ｋ麄冏畛跏怯眯酒谠u(píng)估基因表達(dá)，但現(xiàn)在他們已經(jīng)引入了RNA測(cè)序數(shù)據(jù)，以獲得更為豐富的信息。

 

沒(méi)有底線的檢測(cè)

 

芯片檢測(cè)的動(dòng)態(tài)范圍比較窄，在轉(zhuǎn)錄本豐度很低的情況下，RNA-seq才是你正確的選擇。Tong及其同事去年用Illumina RNA-seq平臺(tái)和Affymetrix芯片，評(píng)估了大鼠肝臟在藥物處理下的基因表達(dá)改變。他們發(fā)現(xiàn)，在檢測(cè)豐度較高的基因時(shí)，RNA-seq和芯片的結(jié)果基本一致。但在檢測(cè)表達(dá)水平低的基因時(shí)，RNA-seq更加準(zhǔn)確。這一結(jié)論也得到了其他一些研究的支持。

 

造成這種差異的主要原因是，當(dāng)基因低水平表達(dá)時(shí)，芯片中結(jié)合探針的cDNA發(fā)出較弱的熒光，難以壓倒背景熒光。對(duì)于RNA-seq而言，覆蓋度越高能檢測(cè)的轉(zhuǎn)錄本水平就越低，沒(méi)有絕對(duì)的下限。當(dāng)然，RNA-seq也沒(méi)有絕對(duì)的檢測(cè)上限。而芯片在檢測(cè)表達(dá)量很高的基因時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)飽和。

 

生命力依然頑強(qiáng)

 

盡管RNA-seq有許多優(yōu)勢(shì)，但許多研究者還是在繼續(xù)使用芯片，尤其是樣本量比較大的研究。芯片在臨床研究中也很吃香，因?yàn)樗臄?shù)據(jù)處理又快又簡(jiǎn)單。“芯片能提供高度一致的數(shù)據(jù)，分析軟件也相當(dāng)成熟，”Poon說(shuō)。“通過(guò)分析成百上千的樣本，基因和miRNA的表達(dá)特征已經(jīng)被賦予了臨床上的診斷價(jià)值。”

 

“我會(huì)一直使用芯片，”MitoGenetics公司的Kirk Mantione說(shuō)。“我知道要做些什么，結(jié)果也更容易解讀。”

 

Mantione使用芯片對(duì)自己開(kāi)發(fā)的藥物進(jìn)行評(píng)估，在細(xì)胞系和動(dòng)物中分析這些藥物對(duì)基因表達(dá)的影響。芯片可以快速給出結(jié)果，展示藥物對(duì)特定基因的作用。不過(guò)Mantione也希望用RNA-seq研究那些還不成熟的生物模型，或者尋找之前沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄本多態(tài)性。

 

有時(shí)候，人們繼續(xù)使用芯片只是因?yàn)橄胍獙?duì)新數(shù)據(jù)和舊數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，如果所有的數(shù)據(jù)都是以同樣的方式獲得的，比較起來(lái)自然更為容易。

 

Affymetrix公司建議大家先用芯片快速篩查大量樣本，然后用這些結(jié)果指導(dǎo)RNA-seq。此外，芯片也可以用來(lái)驗(yàn)證RNA-seq的數(shù)據(jù)。

 

RNA-seq數(shù)據(jù)分析

 

RNA-seq有非常廣泛的應(yīng)用，但沒(méi)有哪個(gè)分析軟件是萬(wàn)能的?？茖W(xué)家們一般會(huì)根據(jù)自己的研究對(duì)象和研究目標(biāo)，采用不同的數(shù)據(jù)分析策略?，F(xiàn)在人們已經(jīng)發(fā)表了大量的RNA-seq和數(shù)據(jù)分析方案，對(duì)于剛?cè)腴T的新手來(lái)說(shuō)難免有些無(wú)所適從。

 

佛羅里達(dá)大學(xué)、加州大學(xué)Irvine分校等單位的研究人員在一月二十六日的Genome Biology雜志上發(fā)表文章，概述了RNA-seq生物信息學(xué)分析的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)和現(xiàn)有資源，為人們提供了一份帶有注釋的RNA-seq數(shù)據(jù)分析指南。這將成為開(kāi)展RNA-seq研究的寶貴參考資料。

 

這份指南覆蓋了RNA-seq數(shù)據(jù)分析的所有主要步驟，比如質(zhì)量控制、讀段比對(duì)、基因和轉(zhuǎn)錄本定量、差異性基因表達(dá)、功能分析、基因融合檢測(cè)、eQTL圖譜分析等等。研究人員繪制的RNA-seq分析通用路線圖（標(biāo)準(zhǔn)Illumina測(cè)序），將主要分析步驟分為前期分析、核心分析和高級(jí)分析三類。前期預(yù)處理包括實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、測(cè)序設(shè)計(jì)和質(zhì)量控制。核心分析包括轉(zhuǎn)錄組圖譜分析、差異基因表達(dá)和功能分析。高級(jí)分析包括可視化、其他RNA-seq技術(shù)和數(shù)據(jù)整合。

 

研究人員在文章中探討了每個(gè)步驟所面臨的挑戰(zhàn)，也評(píng)估了一些數(shù)據(jù)處理方法的潛力和局限。此外，他們還介紹了RNA-seq數(shù)據(jù)與其他數(shù)據(jù)類型的整合。這種數(shù)據(jù)整合可以將基因表達(dá)調(diào)控與分子生理學(xué)和功能基因組學(xué)關(guān)聯(lián)起來(lái)，如今越來(lái)越受到研究者的歡迎。