遺傳篩查是研究哺乳動物細(xì)胞中基因功能的強(qiáng)大工具。將基因擾動與細(xì)胞表型相關(guān)聯(lián)，目前主要有兩種方法：芯片篩查和混合篩查。芯片篩查能揭示高分辨率的表型，但其通量有限且價(jià)格不菲?；旌虾Y查則能夠快速篩查數(shù)千個擾動，效率高，擴(kuò)展性好，但它不能揭示每個擾動的詳細(xì)表型。

如今，四項(xiàng)近期發(fā)表的研究為遺傳篩查帶來了第三種選擇，將芯片篩查和混合篩查的優(yōu)勢相結(jié)合。三個獨(dú)立的研究小組開發(fā)出CROP-seq、CRISP-seq和Perturb-seq技術(shù)，它們利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)在單個樣品中平行生成數(shù)千個基因擾動。之后利用單細(xì)胞RNA-Seq，同時(shí)測定每個細(xì)胞的擾動和表型。

這些新方法將豐富的表型信息與每個特定擾動相關(guān)聯(lián)，實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜分析。奧地利科學(xué)院的Christoph Bock表示：“這些方法建立了一種新的高通量篩查范例，結(jié)合了混合篩查與芯片篩查的主要優(yōu)點(diǎn)，從而有助于我們更有效地探索新穎的生物學(xué)機(jī)制。”

Perturb-seq

在《Cell》雜志上發(fā)表的兩項(xiàng)研究中，加州大學(xué)舊金山分校的Jonathan Weissman和Broad研究院的Aviv Regev介紹了一種稱為Perturb-seq的新方法。Broad的團(tuán)隊(duì)使用這種方法分析了20萬個細(xì)胞，重點(diǎn)在調(diào)控樹突狀細(xì)胞反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子。Perturb-seq準(zhǔn)確鑒定了受擾動影響的單個基因靶點(diǎn)、基因特征和細(xì)胞狀態(tài)。

Weissman實(shí)驗(yàn)室的博士后研究員、其中一篇文章的共同第一作者Britt Adamson表示：“Perturb-seq填補(bǔ)了當(dāng)前功能基因組學(xué)研究的一大缺口。它提供了一種革命性的工具，能夠快速系統(tǒng)地剖析細(xì)胞中所有主要的轉(zhuǎn)錄通路。”

這種基于CRISPR-Cas9的方法依賴設(shè)計(jì)的向?qū)?/span>RNA來實(shí)現(xiàn)靶向的基因組編輯。據(jù)作者介紹，主要的瓶頸在于開發(fā)細(xì)胞條形碼策略，以便準(zhǔn)確捕獲哪個向?qū)?/span>RNA在特定細(xì)胞中表達(dá)，以及哪個基因被擾動。他們的研究十分了不起，在擴(kuò)大單細(xì)胞數(shù)量的同時(shí)，還能夠?qū)_動準(zhǔn)確分配到每個細(xì)胞。

CRISP-seq和CROP-seq

在同一期的《Cell》雜志上，以色列魏茨曼研究所的Ido Amit團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用新方法CRISP-seq來探索先天免疫的調(diào)控回路。他們采集了數(shù)萬個受擾動的細(xì)胞，并鑒定了控制骨髓細(xì)胞分化及其對病原體反應(yīng)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。據(jù)作者介紹，結(jié)果表明CRISP-seq可以作為一種通用方法來探索哺乳動物細(xì)胞的調(diào)控，同時(shí)有望用于未來免疫細(xì)胞的改造。

在這幾篇文章發(fā)布后不久，Bock及其團(tuán)隊(duì)在《Nature Methods》上介紹了一種新方法：CRISPR液滴測序（簡稱CROP-seq）。這種方法結(jié)合了四大關(guān)鍵要素：向?qū)?/span>RNA載體，高通量的單細(xì)胞RNA-seq檢測，分配單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的計(jì)算管道，以及分析和解釋向?qū)?/span>RNA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄圖譜的生物信息學(xué)方法。與Perturb-seq和CRISP-seq相比，CROP-seq的優(yōu)勢在于能直接讀取向?qū)?/span>RNA，這大大簡化了單細(xì)胞CRISPR篩查，使其與混合篩查中的標(biāo)準(zhǔn)克隆方案完全兼容。

盡管這種方法目前僅支持單細(xì)胞RNA-seq，但單細(xì)胞多組學(xué)方案很快將投入使用。在未來的研究中，Bock及其團(tuán)隊(duì)打算利用CROP-seq來開展癌癥研究，探索表觀基因組編輯的潛力。他們的計(jì)劃是在正常細(xì)胞中引入特定的表觀遺傳缺陷，將它們轉(zhuǎn)化成癌細(xì)胞，從而證明表觀遺傳在癌癥中的作用。同時(shí)，他們也有意將癌細(xì)胞重編程為惡性程度較低的細(xì)胞，希望找出那些調(diào)節(jié)細(xì)胞命運(yùn)而不是殺死所有細(xì)胞的潛在治療方法。

機(jī)遇與挑戰(zhàn)

與之前開發(fā)的方法相比，這些新方法具有明顯的優(yōu)勢。首先，它們提供了一種通用型檢測，可同時(shí)捕獲各種表型，而不依賴生物標(biāo)志物。對于之前那些難以開展混合篩查的應(yīng)用，它們能夠輕松勝任。其次，這些方法還能充分利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)的靈活性，比如基因沉默（CRISPRi）或激活（CRISPRa）。

從臨床的角度來看，這些方法有望直接應(yīng)用在包含數(shù)萬個細(xì)胞的活檢樣本上。“將單細(xì)胞CRISPR技術(shù)用在復(fù)雜的異質(zhì)組織上，這將是令人興奮的，如原發(fā)性腫瘤，其中每種細(xì)胞類型對治療藥物都可能有不同的反應(yīng)。通過單細(xì)胞CRISPR測序，我們現(xiàn)在能檢測同一腫瘤中的不同細(xì)胞是否依賴不同的基因來應(yīng)對化療，”Bock說。

當(dāng)然，這些方法也有一些實(shí)際的問題。據(jù)Bock介紹，一個問題是單細(xì)胞RNA-seq的成本太高，使得目前的篩查規(guī)模限制在1000個目標(biāo)基因。不過正如Dixit所指出的，這一成本有望隨著時(shí)間的推移而下降。“在過去幾年，單個細(xì)胞的測序成本下降了100倍，在未來幾年可能還會下降10-100倍，”Dixit說。目前，開展全基因組范圍篩查的成本大約是10萬到100萬美元，具體取決于你想要哪些細(xì)節(jié)。

在技術(shù)層面，Weissman及其團(tuán)隊(duì)正在努力簡化和擴(kuò)展他們的方法。通過改進(jìn)一些方面，他們相信能提高效率，并降低成本。他們還計(jì)劃繼續(xù)改進(jìn)計(jì)算方法，以便更好地了解數(shù)據(jù)。“盡管這項(xiàng)技術(shù)還很年輕，但若擴(kuò)展到全基因組規(guī)模的功能基因組學(xué)，并沒有內(nèi)在的限制，”Weissman說。