克隆的道路有很多條，比如TA克隆、不依賴連接反應(yīng)的克?。↙IC）、重組酶依賴的克隆等等。TA克隆和LIC都需要末端修飾，而這種修飾不容易被凝膠電泳等技術(shù)檢測(cè)。重組酶通常又是和克隆試劑盒捆綁銷售的，因此研究人員也很難優(yōu)化重組反應(yīng)。于是，美國(guó)艾默里大學(xué)生物化學(xué)系的Anton V. Bryksin和Ichiro Matsumura開發(fā)出一種PCR介導(dǎo)的克隆方法-重疊延伸PCR克隆（Overlap extension PCR cloning），相當(dāng)簡(jiǎn)單且可靠。

克隆過(guò)程如下：一開始用嵌合體引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生了線性的插入片段，且片段兩端都有載體序列。然后將載體和插入片段混合，變性并退火，隨后將載體作為模板，用Phusion DNA聚合酶延伸雜交后的插入片段，直到聚合酶到達(dá)插入片段的5’端。在幾輪PCR循環(huán)后，反應(yīng)的終產(chǎn)物是帶有兩個(gè)缺口（每條鏈一個(gè)）的雙鏈融合質(zhì)粒。利用DpnI限制性內(nèi)切酶消化，除去母板質(zhì)粒，新質(zhì)粒則轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，DNA修復(fù)酶將缺口封住。

研究人員在反應(yīng)中使用的是NEB公司的Phusion DNA聚合酶，他們認(rèn)為這很關(guān)鍵，因?yàn)榇嗣副Ｕ娑雀撸也粨碛墟溨脫Q活性。研究人員還比較了五種不同的DNA聚合酶，認(rèn)為這個(gè)最好。反應(yīng)中只需要DNA聚合酶，而不再需要操作多個(gè)限制性內(nèi)切酶、重組酶、連接酶和糖基化酶等。

在原理驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)中，研究人員首先克隆了gfp。他們認(rèn)為，高濃度的插入片段和相對(duì)低的退火溫度（比計(jì)算出的退火溫度低5-10°C）對(duì)于高效的重疊延伸是很重要的。轉(zhuǎn)化后的重組子有98%以上呈綠色，說(shuō)明克隆錯(cuò)誤和原始載體的殘留極低。

研究人員還比較了PCR循環(huán)數(shù)對(duì)克隆效率的影響。他們發(fā)現(xiàn)：在最初15個(gè)循環(huán)，重組克隆數(shù)量不斷增加，在17-18個(gè)循環(huán)達(dá)到高峰。之后的循環(huán)導(dǎo)致克隆數(shù)量略微下降。隨后，他們還比較了三種不同的載體：插入片段比例（1：5、1：50和1：250）。他們發(fā)現(xiàn)，1：250的比例產(chǎn)生了最多的重組克隆。

他們應(yīng)用這種克隆方法克隆了4個(gè)基因：gfp（1 kb）、gusA（1.9 kb）、lacZ（3.2 kb）和整個(gè)luxABCDE操縱子（6 kb）。他們利用限制性酶切分析和報(bào)告蛋白功能來(lái)驗(yàn)證了所有重組質(zhì)粒的正確結(jié)構(gòu)。此方法的錯(cuò)誤率低于3%，而與片段大小無(wú)關(guān)。不過(guò)，研究人員觀察到，隨著片段長(zhǎng)度的增加，轉(zhuǎn)化后的克隆數(shù)量下降。曲線圖暗示插入片段的上限是6.7 kb。