1．啟動(dòng)子

啟動(dòng)子是DNA鏈上一段能與RNA聚合酶結(jié)合并起始RNA合成的序列，它是基因表達(dá)不可缺少的重要調(diào)控序列。沒有啟動(dòng)子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。由于細(xì)菌RNA聚合酶不能識(shí)別真核基因的啟動(dòng)子，因此原核表達(dá)載體所用的啟動(dòng)子必須是原核啟動(dòng)子。

原核啟動(dòng)子是由兩段彼此分開且又高度保守的核苷酸序列組成，對(duì)mRNA的合成極為重要。在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游5～10 bp處，有一段由6～8個(gè)堿基組成，富含A和T的區(qū)域，稱為Pribnow 盒，又名TATA 盒或－10區(qū)。來源不同的啟動(dòng)子，Pribnow 盒的堿基順序稍有變化。在距轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游35 bp處，有一段由10 bp組成的區(qū)域，稱為-35區(qū)。轉(zhuǎn)錄時(shí)大腸桿菌RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合啟動(dòng)子。-35區(qū)與RNA聚合酶 s 亞基結(jié)合，-10區(qū)與RNA聚合酶的核心酶結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近DNA被解旋形成單鏈，RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯鍵，以后在RNA聚合酶作用下向前推進(jìn)，形成新生的RNA鏈。

原核表達(dá)系統(tǒng)中通常使用的可調(diào)控的啟動(dòng)子有Lac(乳糖啟動(dòng)子)、Trp(色氨酸啟動(dòng)子)、Tac(乳糖和色氨酸的雜合啟動(dòng)子)、l PL (l 噬菌體的左向啟動(dòng)子)、T7噬菌體啟動(dòng)子等。

（1）Lac啟動(dòng)子：它來自大腸桿菌的乳糖操縱子，是DNA分子上一段有方向的核苷酸序列，由阻遏蛋白基因(LacI)、啟動(dòng)基因(P)、操縱基因(O)和編碼3個(gè)與乳糖利用有關(guān)的酶的基因結(jié)構(gòu)所組成。Lac啟動(dòng)子受分解代謝系統(tǒng)的正調(diào)控和阻遏物的負(fù)調(diào)控。正調(diào)控通過CAP(catabolite gene activation protein)因子和cAMP來激活啟動(dòng)子，促使轉(zhuǎn)錄進(jìn)行。負(fù)調(diào)控則是由調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生LacZ阻遏蛋白，該阻遏蛋白能與操縱基因結(jié)合阻止轉(zhuǎn)錄。乳糖及某些類似物如IPTG可與阻遏蛋白形成復(fù)合物，使其構(gòu)型改變，不能與O基因結(jié)合，從而解除這種阻遏，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄發(fā)生。

（2）trp啟動(dòng)子：它來自大腸桿菌的色氨酸操縱子，其阻遏蛋白必須與色氨酸結(jié)合才有活性。當(dāng)缺乏色氨酸時(shí)，該啟動(dòng)子開始轉(zhuǎn)錄。當(dāng)色氨酸較豐富時(shí)，則停止轉(zhuǎn)錄。b^-吲哚丙烯酸可競爭性抑制色氨酸與阻遏蛋白的結(jié)合，解除阻遏蛋白的活性，促使trp啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。

（3）Tac啟動(dòng)子：Tac啟動(dòng)子是一組由Lac和trp啟動(dòng)子人工構(gòu)建的雜合啟動(dòng)子，受Lac阻遏蛋白的負(fù)調(diào)節(jié)，它的啟動(dòng)能力比Lac和trp都強(qiáng)。其中Tac 1是由Trp啟動(dòng)子的－35區(qū)加上一個(gè)合成的46 bp DNA片段(包括Pribnow 盒)和Lac操縱基因構(gòu)成，Tac 12是由Trp的啟動(dòng)子-35區(qū)和Lac啟動(dòng)子的-10區(qū)，加上Lac操縱子中的操縱基因部分和SD序列融合而成。Tac啟動(dòng)子受IPTG的誘導(dǎo)。

（4）l PL 啟動(dòng)子：它來自 l 噬菌體早期左向轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，是一種活性比Trp啟動(dòng)子高11倍左右的強(qiáng)啟動(dòng)子。l PL 啟動(dòng)子受控于溫度敏感的阻遏物cIts857。在低溫(30 ℃ )時(shí)，cIts857阻遏蛋白可阻遏PL 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。在高溫(45 ℃ )時(shí)，cIts857蛋白失活，阻遏解除，促使PL 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。系統(tǒng)由于受cIts857作用，尤其適合于表達(dá)對(duì)大腸桿菌有毒的基因產(chǎn)物，缺點(diǎn)是溫度轉(zhuǎn)換不僅可誘導(dǎo)PL 啟動(dòng)子，也可誘導(dǎo)熱休克基因，其中有一些熱休克基因編碼蛋白酶。如果用 l 噬菌體cI⁺ 溶源菌，并用絲裂霉素C或萘啶酮酸進(jìn)行誘導(dǎo)，可緩解這一矛盾。

（5）T7噬菌體啟動(dòng)子：它是來自T7噬菌體的啟動(dòng)子，具有高度的特異性，只有T7RNA聚合酶才能使其啟動(dòng)，故可以使克隆 化基因獨(dú)自得到表達(dá)。T7RNA聚合酶的效率比大腸桿菌 RNA聚合酶高5倍左右，它能使質(zhì)粒沿模板連續(xù)轉(zhuǎn)錄幾周，許多外源終止子都不能有效地終止它的序列，因此它可轉(zhuǎn)錄某些不能被大腸桿菌RNA聚合酶有效轉(zhuǎn)錄的序列。這個(gè)系統(tǒng)可以高效表達(dá)其他系統(tǒng)不能有效表達(dá)的基因。但要注意用這種啟動(dòng)子時(shí)宿主中必須含有T7RNA聚合酶。應(yīng)用T7噬菌體表達(dá)系統(tǒng)需要2個(gè)條件：第一是具有T7噬菌體RNA聚合酶，它可以由感染的 l 噬菌體或由插入大腸桿菌染色體上的一個(gè)基因拷貝產(chǎn)生；第二是在一個(gè)待表達(dá)基因上游帶有T7噬菌體啟動(dòng)子的載體。

2．SD序列

1974年Shine和Dalgarno首先發(fā)現(xiàn)，在mRNA上有核糖體的結(jié)合位點(diǎn)，它們是起始密碼子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp處的由3～9 bp組成的序列。這段序列富含嘌呤核苷酸，剛好與16S rRNA 3 ¢ 末端的富含嘧啶的序列互補(bǔ)，是核糖體RNA的識(shí)別與結(jié)合位點(diǎn)。以后將此序列命名為Shine-Dalgarno序列，簡稱SD序列。它與起始密碼子AUG之間的距離是影響mRNA轉(zhuǎn)錄、翻譯成蛋白的重要因素之一，某些蛋白質(zhì)與SD序列結(jié)合也會(huì)影響mRNA與核糖體的結(jié)合，從而影響蛋白質(zhì)的翻譯。另外，真核基因的第二個(gè)密碼子必須緊接在ATG之后，才能產(chǎn)生一個(gè)完整的蛋白質(zhì)。

3．終止子

在一個(gè)基因的3¢末端或是一個(gè)操縱子的3¢末端往往有特定的核苷酸序列，且具有終止轉(zhuǎn)錄功能，這一序列稱之為轉(zhuǎn)錄終止子，簡稱終止子(terminator)。轉(zhuǎn)錄終止過程包括：RNA聚合酶停在DNA模板上不再前進(jìn)，RNA的延伸也停止在終止信號(hào)上，完成轉(zhuǎn)錄的RNA從RNA聚合酶上釋放出來。對(duì)RNA聚合酶起強(qiáng)終止作用的終止子在結(jié)構(gòu)上有一些共同的特點(diǎn)，即有一段富含A/T的區(qū)域和一段富含G/C的區(qū)域，G/C富含區(qū)域又具有回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)。這段終止子轉(zhuǎn)錄后形成的RNA具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，并且有與A/T富含區(qū)對(duì)應(yīng)的一串U。轉(zhuǎn)錄終止的機(jī)制較為復(fù)雜，并且結(jié)論尚不統(tǒng)一。但在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，為了穩(wěn)定載體系統(tǒng)，防止克隆 的外源基因表達(dá)干擾載體的穩(wěn)定性，一般都在多克隆 位點(diǎn)的下游插入一段很強(qiáng)的rrB核糖體RNA的轉(zhuǎn)錄終止子。