上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院上海血液學(xué)研究所的陳竺院士和陳賽娟院士領(lǐng)導(dǎo)的研究小組近日在《Nature Genetics》上發(fā)表了一篇文章。他們利用外顯子組測序（exome sequencing），發(fā)現(xiàn)了急性單核細(xì)胞白血?。ˋML-M5）中的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因DNMT3A突變。

盡管近年來一些研究發(fā)現(xiàn)抑癌基因甲基化在急性白血病中普遍存在，然而由于常規(guī)的全基因組測序技術(shù)存在著工作量大、耗時(shí)長、成本高等局限，使得目前只有少數(shù)基因的甲基化狀態(tài)被確定與患者的臨床特征即預(yù)后有關(guān)。外顯子組測序是一種新型的基因組分析技術(shù)。由于外顯子組僅占人類基因組的百分之一。測定外顯子序列只需針對外顯子區(qū)域的DNA即可，因此遠(yuǎn)比全基因組測序更簡便、經(jīng)濟(jì)，近年來也開始廣泛應(yīng)用到遺傳病的相關(guān)研究中。

在這項(xiàng)研究中，研究人員首先利用Ficoll梯度離心從9個(gè)AML-M5病例的骨髓樣本及對照外周血中分離出單核細(xì)胞，然后從新鮮制備的細(xì)胞中抽提出基因組DNA，用于外顯子組測序。

外顯子組捕獲是在羅氏NimbleGen的2.1M人外顯子組芯片上開展的。此款芯片包含210萬個(gè)探針，最多能捕獲50 Mb區(qū)域。研究人員從每個(gè)外顯子組中捕獲出24 Mb區(qū)域。隨后通過連接介導(dǎo)的PCR擴(kuò)增這些片段，純化后就交予Illumina平臺開展DNA測序。

簇生成是在Illumina的簇生成工作站上開展的，流程如下：模板雜交、等溫?cái)U(kuò)增、線性化、阻斷、變性和測序引物雜交。之后，研究人員利用Illumina的Genome Analyzer IIx平臺（GAIIx）對捕獲的文庫開展深度測序。定向區(qū)域中每個(gè)堿基的平均覆蓋度為100倍，且這些堿基中的95.3%有著足夠深的覆蓋度（>10倍），能夠進(jìn)行變異體檢出。

研究人員利用內(nèi)部的軟件系統(tǒng)，將骨髓外顯子組數(shù)據(jù)組中鑒定出的變異體與dbSNP和外周血對照中存在的種系變異相比較。他們鑒定出266個(gè)潛在的體細(xì)胞序列改變，包括220個(gè)單核苷酸變異（SNV）和46個(gè)小的插入或缺失（indel）。

之后，研究重點(diǎn)放在一些可能會影響蛋白編碼序列的變化上，包括59個(gè)非無義替換和10個(gè)影響ORF完整性的indel上。對了驗(yàn)證，他們利用PCR直接從原始樣本中擴(kuò)增出相應(yīng)的基因組區(qū)域，并開展Sanger測序。其中98.3%（58個(gè)）SNV被證實(shí)為體細(xì)胞突變，而80%（8個(gè)）indel被證實(shí)。至此，他們鑒定出63個(gè)基因中的66個(gè)體細(xì)胞突變，其中3個(gè)基因包含兩種情況。

接下來，他們對另外5個(gè)病例（無配對正常樣本）開展了外顯子組測序，著重研究那63個(gè)基因。為了排除稀有SNP，他們又對509個(gè)對照樣本進(jìn)行了分析。之后，研究人員對另外98個(gè)病例（M5驗(yàn)證組）的骨髓DNA樣本進(jìn)行基因分型。結(jié)果，他們在14個(gè)基因中發(fā)現(xiàn)了體細(xì)胞突變或很可能的體細(xì)胞突變，每個(gè)突變都至少在兩個(gè)病例中檢測到。

通過上述數(shù)據(jù)的整合，并綜合文獻(xiàn)研究，研究人員選擇出6個(gè)基因（DNMT3A, NSD1, GATA2, CCND3, ATP2A2 和C10orf2），并對M5驗(yàn)證組中它們的編碼區(qū)域進(jìn)行測序。在編碼DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的DNMT3A中，研究人員鑒定出多個(gè)變異，其中p.Arg882His、p.Arg882Cys和 p.Val897Asp被證實(shí)由體細(xì)胞突變產(chǎn)生，而p.Arg478Trp、p.Gly543Cys和p.Arg882Ser不存在與對照驗(yàn)證組中，因此很可能是由體細(xì)胞突變產(chǎn)生。這樣，112個(gè)病例中的23例存在DNMT3A突變，突變頻率為20.5%。

DNMT3A突變體功能分析結(jié)果顯示酶活性減少，或與組蛋白H3的親和力異常。值得一提的是，研究人員證實(shí)DNMT3A突變樣本中的DNA甲基化模式和/或基因表達(dá)譜均發(fā)生了改變。DNMT3A突變與急性白血病高發(fā)病率及預(yù)后不良有著密切的關(guān)系。此外，研究人員還在篩查其他白血病亞型時(shí)發(fā)現(xiàn)13.6%的急性粒細(xì)胞白血病（AML-M4）的病例存在Arg882改變。

這一研究發(fā)現(xiàn)證實(shí)了異常的DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶活性與急性單核細(xì)胞性白血病發(fā)病密切相關(guān)，并為疾病的診斷和預(yù)后評價(jià)提供了一個(gè)有潛力的生物標(biāo)記。

大規(guī)模并行測序技術(shù)的開發(fā)讓癌癥的突變測定變得可行，然而，全基因組測序工作量大，耗時(shí)長，成本高，關(guān)鍵是數(shù)據(jù)分析也相當(dāng)復(fù)雜，面對海量的數(shù)據(jù)，你根本無從下手。外顯子組捕獲工具的出現(xiàn)，讓致病基因的發(fā)現(xiàn)變得簡單。科學(xué)家們普遍認(rèn)為外顯子組測序比全基因組測序更有優(yōu)勢，不僅僅是費(fèi)用更低，數(shù)據(jù)的闡釋也更為簡單。

在過去的兩年內(nèi)，研究人員利用外顯子組測序，發(fā)現(xiàn)了多種孟德爾疾病及更為復(fù)雜疾病（如癌癥）的關(guān)鍵基因。這種技術(shù)也被《Science》雜志評為2010年十大科學(xué)突破。如今，新一代測序的費(fèi)用越來越低，序列捕獲的產(chǎn)品也越來越豐富，使得外顯子組測序的門檻越來越低。相信在不久的將來，國內(nèi)也能利用這種技術(shù)發(fā)現(xiàn)更多疾病的秘密。