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“瘦肉精門”拷問科學家的良知

日期:2011-04-06 16:05:38

(一)根據(jù)配體特異性的分離方法-親和色譜法

親和層析法(aflinity chromatography)是分離蛋白質(zhì)的一種極為有效的方法,它經(jīng)常只需經(jīng)過一步處理即可使某種待提純的蛋白質(zhì)從很復雜的蛋白質(zhì)混合物中分離出來,而且純度很高。這種方法是根據(jù)某些蛋白質(zhì)與另一種稱為配體(Ligand)的分子能特異而非共價地結(jié)合。其基本原理:蛋白質(zhì)在組織或細胞中是以復雜的混合物形式存在,每種類型的細胞都含有上千種不同的蛋白質(zhì),因此蛋白質(zhì)的分離(Separation),提純(Purification)和鑒定(Characterization)是生物化學中的重要的一部分,至今還沒的單獨或一套現(xiàn)成的方法能移把任何一種蛋白質(zhì)從復雜的混合蛋白質(zhì)中提取出來,因此往往采取幾種方法聯(lián)合使用。

(二)根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的差別的分離方法

1、透析與超濾

透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質(zhì)分開。

超濾法是利用高壓力或離心力,強使水和其他小的溶質(zhì)分子通過半透膜,而蛋白質(zhì)留在膜上,可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質(zhì)。

2、凝膠過濾法

也稱分子排阻層析或分子篩層析,這是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠(Sephadex ged)和瓊脂糖凝膠(agarose gel)。

(三)根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)進行分離

蛋白質(zhì)在不同pH環(huán)境中帶電性質(zhì)和電荷數(shù)量不同,可將其分開。

1、電泳法

各種蛋白質(zhì)在同一pH條件下,因分子量和電荷數(shù)量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳,這是利用一種兩性電解質(zhì)作為載體,電泳時兩性電解質(zhì)形成一個由正極到負極逐漸增加的pH梯度,當帶一定電荷的蛋白質(zhì)在其中泳動時,到達各自等電點的pH位置就停止,此法可用于分析和制備各種蛋白質(zhì)。

2、離子交換層析法

離子交換劑有陽離子交換劑(如:羧甲基纖維素;CM-纖維素)和陰離子交換劑(二乙氨基乙基纖維素;DEAE?FONT FACE="宋體" LANG="ZH-CN">纖維素),當被分離的蛋白質(zhì)溶液流經(jīng)離子交換層析柱時,帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質(zhì)被吸附在離子交換劑上,隨后用改變pH或離子強度辦法將吸附的蛋白質(zhì)洗脫下來。

(四)根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同的分離方法

1、蛋白質(zhì)的鹽析

中性鹽對蛋白質(zhì)的溶解度有顯著影響,一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高,蛋白質(zhì)的溶解度增加,此稱鹽溶;當鹽濃度繼續(xù)升高時,蛋白質(zhì)的溶解度不同程度下降并先后析出,這種現(xiàn)象稱鹽析,將大量鹽加到蛋白質(zhì)溶液中,高濃度的鹽離子(如硫酸銨的SO4和NH4)有很強的水化力,可奪取蛋白質(zhì)分子的水化層,使之“失水”,于是蛋白質(zhì)膠粒凝結(jié)并沉淀析出。鹽析時若溶液pH在蛋白質(zhì)等電點則效果更好。由于各種蛋白質(zhì)分子顆粒大小、親水程度不同,故鹽析所需的鹽濃度也不一樣,因此調(diào)節(jié)混合蛋白質(zhì)溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀。

影響鹽析的因素有:(1)溫度:除對溫度敏感的蛋白質(zhì)在低溫(4度)操作外,一般可在室溫中進行。一般溫度低蛋白質(zhì)溶介度降低。但有的蛋白質(zhì)(如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白)在較高的溫度(25度)比0度時溶解度低,更容易鹽析。(2)pH值:大多數(shù)蛋白質(zhì)在等電點時在濃鹽溶液中的溶介度最低。(3)蛋白質(zhì)濃度:蛋白質(zhì)濃度高時,欲分離的蛋白質(zhì)常常夾雜著其他蛋白質(zhì)地一起沉淀出來(共沉現(xiàn)象)。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋,使蛋白質(zhì)含量在2.5-3.0%。

蛋白質(zhì)鹽析常用的中性鹽,主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。 其中應用最多的硫酸銨,它的優(yōu)點是溫度系數(shù)小而溶解度大(25度時飽和溶液為4.1M,即767克/升;0度時飽和溶解度為3.9M,即676克/升),在這一溶解度范圍內(nèi),許多蛋白質(zhì)和酶都可以鹽析出來;另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好,不易引起蛋白質(zhì)變性。硫酸銨溶液的pH常在4.5-5.5之間,當用其他pH值進行鹽析時,需用硫酸或氨水調(diào)節(jié)。

蛋白質(zhì)在用鹽析沉淀分離后,需要將蛋白質(zhì)中的鹽除去,常用的辦法是透析,即把蛋白質(zhì)溶液裝入秀析袋內(nèi)(常用的是玻璃紙),用緩沖液進行透析,并不斷的更換緩沖液,因透析所需時間較長,所以最好在低溫中進行。此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過柱的辦法除鹽,所用的時間就比較短。

2、等電點沉淀法

蛋白質(zhì)在靜電狀態(tài)時顆粒之間的靜電斥力最小,因而溶解度也最小,各種蛋白質(zhì)的等電點有差別,可利用調(diào)節(jié)溶液的pH達到某一蛋白質(zhì)的等電點使之沉淀,但此法很少單獨使用,可與鹽析法結(jié)合用。

3、低溫有機溶劑沉淀法

用與水可混溶的有機溶劑,甲醇,乙醇或丙酮,可使多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度降低并析出,此法分辨力比鹽析高,但蛋白質(zhì)較易變性,應在低溫下進行。

(一)根據(jù)配體特異性的分離方法-親和色譜法

親和層析法(aflinity chromatography)是分離蛋白質(zhì)的一種極為有效的方法,它經(jīng)常只需經(jīng)過一步處理即可使某種待提純的蛋白質(zhì)從很復雜的蛋白質(zhì)混合物中分離出來,而且純度很高。這種方法是根據(jù)某些蛋白質(zhì)與另一種稱為配體(Ligand)的分子能特異而非共價地結(jié)合。其基本原理:蛋白質(zhì)在組織或細胞中是以復雜的混合物形式存在,每種類型的細胞都含有上千種不同的蛋白質(zhì),因此蛋白質(zhì)的分離(Separation),提純(Purification)和鑒定(Characterization)是生物化學中的重要的一部分,至今還沒的單獨或一套現(xiàn)成的方法能移把任何一種蛋白質(zhì)從復雜的混合蛋白質(zhì)中提取出來,因此往往采取幾種方法聯(lián)合使用。

(二)根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的差別的分離方法

1、透析與超濾

透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質(zhì)分開。

超濾法是利用高壓力或離心力,強使水和其他小的溶質(zhì)分子通過半透膜,而蛋白質(zhì)留在膜上,可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質(zhì)。

2、凝膠過濾法

也稱分子排阻層析或分子篩層析,這是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠(Sephadex ged)和瓊脂糖凝膠(agarose gel)。

(三)根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)進行分離

蛋白質(zhì)在不同pH環(huán)境中帶電性質(zhì)和電荷數(shù)量不同,可將其分開。

1、電泳法

各種蛋白質(zhì)在同一pH條件下,因分子量和電荷數(shù)量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳,這是利用一種兩性電解質(zhì)作為載體,電泳時兩性電解質(zhì)形成一個由正極到負極逐漸增加的pH梯度,當帶一定電荷的蛋白質(zhì)在其中泳動時,到達各自等電點的pH位置就停止,此法可用于分析和制備各種蛋白質(zhì)。

2、離子交換層析法

離子交換劑有陽離子交換劑(如:羧甲基纖維素;CM-纖維素)和陰離子交換劑(二乙氨基乙基纖維素;DEAE?FONT FACE="宋體" LANG="ZH-CN">纖維素),當被分離的蛋白質(zhì)溶液流經(jīng)離子交換層析柱時,帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質(zhì)被吸附在離子交換劑上,隨后用改變pH或離子強度辦法將吸附的蛋白質(zhì)洗脫下來。

(四)根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同的分離方法

1、蛋白質(zhì)的鹽析

中性鹽對蛋白質(zhì)的溶解度有顯著影響,一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高,蛋白質(zhì)的溶解度增加,此稱鹽溶;當鹽濃度繼續(xù)升高時,蛋白質(zhì)的溶解度不同程度下降并先后析出,這種現(xiàn)象稱鹽析,將大量鹽加到蛋白質(zhì)溶液中,高濃度的鹽離子(如硫酸銨的SO4和NH4)有很強的水化力,可奪取蛋白質(zhì)分子的水化層,使之“失水”,于是蛋白質(zhì)膠粒凝結(jié)并沉淀析出。鹽析時若溶液pH在蛋白質(zhì)等電點則效果更好。由于各種蛋白質(zhì)分子顆粒大小、親水程度不同,故鹽析所需的鹽濃度也不一樣,因此調(diào)節(jié)混合蛋白質(zhì)溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀。

影響鹽析的因素有:(1)溫度:除對溫度敏感的蛋白質(zhì)在低溫(4度)操作外,一般可在室溫中進行。一般溫度低蛋白質(zhì)溶介度降低。但有的蛋白質(zhì)(如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白)在較高的溫度(25度)比0度時溶解度低,更容易鹽析。(2)pH值:大多數(shù)蛋白質(zhì)在等電點時在濃鹽溶液中的溶介度最低。(3)蛋白質(zhì)濃度:蛋白質(zhì)濃度高時,欲分離的蛋白質(zhì)常常夾雜著其他蛋白質(zhì)地一起沉淀出來(共沉現(xiàn)象)。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋,使蛋白質(zhì)含量在2.5-3.0%。

蛋白質(zhì)鹽析常用的中性鹽,主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。 其中應用最多的硫酸銨,它的優(yōu)點是溫度系數(shù)小而溶解度大(25度時飽和溶液為4.1M,即767克/升;0度時飽和溶解度為3.9M,即676克/升),在這一溶解度范圍內(nèi),許多蛋白質(zhì)和酶都可以鹽析出來;另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好,不易引起蛋白質(zhì)變性。硫酸銨溶液的pH常在4.5-5.5之間,當用其他pH值進行鹽析時,需用硫酸或氨水調(diào)節(jié)。

蛋白質(zhì)在用鹽析沉淀分離后,需要將蛋白質(zhì)中的鹽除去,常用的辦法是透析,即把蛋白質(zhì)溶液裝入秀析袋內(nèi)(常用的是玻璃紙),用緩沖液進行透析,并不斷的更換緩沖液,因透析所需時間較長,所以最好在低溫中進行。此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過柱的辦法除鹽,所用的時間就比較短。

2、等電點沉淀法

蛋白質(zhì)在靜電狀態(tài)時顆粒之間的靜電斥力最小,因而溶解度也最小,各種蛋白質(zhì)的等電點有差別,可利用調(diào)節(jié)溶液的pH達到某一蛋白質(zhì)的等電點使之沉淀,但此法很少單獨使用,可與鹽析法結(jié)合用。

3、低溫有機溶劑沉淀法

用與水可混溶的有機溶劑,甲醇,乙醇或丙酮,可使多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度降低并析出,此法分辨力比鹽析高,但蛋白質(zhì)較易變性,應在低溫下進行。

沸沸揚揚的瘦肉精事件再起波瀾:國內(nèi)“瘦肉精”最初源頭來自一位浙江大學曾任農(nóng)業(yè)部飼料與動物營養(yǎng)重點開放實驗室主任的許梓榮教授,據(jù)稱這位教授1987年在美國弗吉尼亞大學當訪問學者,回國后寫了關于“瘦肉精”的論文,被列為國家科委“八五”攻關項目。

在80年代中旬未知其危害前,“瘦肉精”(當時是鹽酸克倫特羅)項目由于符合了培養(yǎng)瘦肉型豬的要求,作為優(yōu)秀項目引入中國成為八五攻關項目本來無可厚非,但是重點在后面,1989年西班牙相繼出現(xiàn)了中毒事件,之后法國,意大利,美國也出現(xiàn)了此類事件,因此相繼禁止了鹽酸克倫特羅的使用。作為攻關這一領域的主要科學家,理應保持對這一領域發(fā)展動態(tài)的關注,就不應該不知道歐洲,美國都禁止了鹽酸克倫特羅用于。。。那么這個時候這些相關的科研人員做了什么呢?在耗費多年心血刻苦研究剛剛?cè)〉贸晒?,?shù)不清的榮譽正在在召喚,還有極其巨大的經(jīng)濟效益已經(jīng)在招手的時刻,突然發(fā)現(xiàn)這一切可能頃刻化為烏有的時候,他們做出了怎樣的選擇呢?

有三種可能,一是向上級匯報了歐美相繼發(fā)現(xiàn)鹽酸克倫特羅中毒事件而先后被禁用于飼料,反對對其研究成果進行推廣。但是由于其他人在巨大既得利益的驅(qū)使下,隱瞞或者無視其建議,繼續(xù)推廣其研究成果而造成瘦肉精最終泛濫失控,造成了“被隱瞞”;另外的可能二是選擇了沉默,即不匯報,也不推廣,以轉(zhuǎn)換課題來逃避,默認事態(tài)的發(fā)展,三是明知并隱瞞其危害和被禁用的事實,為利益或者榮譽而昧著良心繼續(xù)大力促進“瘦肉精”的推廣。。。。。。

事實的真相是什么,恐怕只有當事人站出來澄清才有答案。

但是我們注意到在1995年許梓榮還在《浙江農(nóng)業(yè)大學學報》上發(fā)表了題為“Clenbuterol對肥育豬作用效果的研究”的文章(Clenbuterol即克侖特羅),文章中闡述了Clenbuterol在促進豬瘦肉增多方面的作用,而且沒有任何文字提到了其副作用,而當時歐洲等地早就報道了相關的中毒事件,作為這一領域的國內(nèi)領銜科學家,難道說這位教授真的不知道嗎?

如果說真不知道國外的情況,那么在1997年國內(nèi)已經(jīng)禁止了輸港豬肉瘦肉精的使用的前提下,1998年許梓榮還在“第三屆全國飼料營養(yǎng)學術研討會”上作出了題為“Clenbuterol和Ractopamine對肥育豬肉質(zhì)的影響”的報告,文章也沒有只字提及相關不良作用。

確實,面對付出了多年心血,即將產(chǎn)生大量商業(yè)價值的科研成果,眼看著巨大利益在招手,試問有多少人在這個時候能有勇氣剎住車,停下來指出自己之前做的東西可能是有害的,讓自己的心血付諸東流?在這個沒有資助可能連實驗室都混不下去的現(xiàn)實社會中,科學家的良知,在巨大的經(jīng)濟利益和社會榮譽面前,到底應該有多少分量?

如果當時這位教授站了出來,高聲疾呼“瘦肉精”的危害,即使他也許再也找不到這樣好的科研轉(zhuǎn)化成果,也許再也不可能得到眾多的科技獎勵,但是這樣的科學家可以說代表了中國的脊梁!將贏得成千上萬人的尊重,在科研道德發(fā)展史上留下濃厚的一筆!

當今的社會紛紛攘攘,急功近利,浮躁的商業(yè)行為直逼最貼近民生的食品行業(yè),從最開始添加甲醇的假酒,到著名的蘇丹紅事件,從引發(fā)奶業(yè)整個行業(yè)震動的三聚氰胺事件,到利用“孔雀綠”處理多寶魚,利用避孕藥催熟的黃鱔,這些等等事件中都不乏有學術人員的推波助瀾——畢竟在第一線上的農(nóng)民,或養(yǎng)殖業(yè)人員大部分都不會知道進行這樣的處理。

那么這些參與的學術人員不了解此類做法的危害嗎?不,怎么可能不知道呢,但是在巨大的利益誘惑的面前,他們違背了自己的科研良知,放棄了道德準則,在出現(xiàn)了各種中毒事件后,他們可有一絲悔改?

逝者如斯,過往已發(fā)生,我們希望的是在未來的日子里,不會再出現(xiàn)更多的××精,××胺,也希望科研人員能謹守科研良知,尊重自己和科學。

后續(xù)報道:

據(jù)齊魯晚報報道,克倫特羅被禁后,許梓榮對β-興奮劑作為飼料添加劑的研究并未停止,他將目光轉(zhuǎn)向了萊克多巴胺(RactoPamine)。  萊克多巴胺是“瘦肉精”中克倫特羅的最佳替代品,其被禁亦稍晚于克倫特羅,中國在2002年明確將其列入《禁止在飼料和動物飲用水中使用的藥物品種目錄》。

1996年到1999年,許梓榮作為主要作者,發(fā)表了多篇萊克多巴胺提高豬瘦肉率的論文,在這些論文中提到了主要副作用:引起動物腿疾。這些論文大多得到了國家科委的資助。事實上目前科研界仍然有為萊克多巴胺“正名”的呼聲,然而萊克多巴胺的副作用明顯且觸目:在美國,一些服用萊克多巴胺的豬不能站立和行走。