PCR技術(shù)從發(fā)明至今已有二十多年的時(shí)間，用于PCR實(shí)驗(yàn)的儀器不斷的推陳出新。然而PCR的基本過(guò)程沒(méi)有太大變化，包括變性-退火-延伸這三步。當(dāng)研究者進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)獲得的結(jié)果不理想時(shí)，他們需要對(duì)PCR的組成要素進(jìn)行優(yōu)化。這其中包括反應(yīng)條件、使用試劑的量甚至是引物等，在這里我們不一一介紹了。很多研究者在進(jìn)行PCR優(yōu)化時(shí)都會(huì)考慮退火溫度的優(yōu)化，這時(shí)就會(huì)進(jìn)行梯度PCR。而為什么要通過(guò)梯度PCR來(lái)優(yōu)化以及如何解決梯度PCR優(yōu)化后所不能解決的問(wèn)題，這些對(duì)很多研究者來(lái)說(shuō)可能并不是很清楚，本文中將會(huì)對(duì)此作一淺析。

梯度PCR是針對(duì)每臺(tái)PCR儀如何設(shè)置合適的退火溫度進(jìn)行摸索。它是以合成引物的退火溫度為參考值，在進(jìn)行同一個(gè)PCR反應(yīng)時(shí)，同時(shí)設(shè)置多個(gè)退火溫度進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)。這些退火溫度呈現(xiàn)梯度遞增或遞減，通過(guò)梯度PCR最終確定適合儀器的退火溫度。

雖然我們可以通過(guò)梯度PCR摸索出適合儀器的退火溫度，但在實(shí)際應(yīng)用中仍然會(huì)遇到諸多困難。例如我們?cè)谝慌_(tái)PCR儀上摸索出合適的退火溫度，當(dāng)換到另一臺(tái)儀器（同一型號(hào)）上進(jìn)行相同PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，有時(shí)獲得的結(jié)果會(huì)不理想；在一臺(tái)PCR儀摸索出的退火溫度，換到其它品牌或型號(hào)的PCR儀上時(shí)，獲得的結(jié)果也是不理想；使用一種耗材獲得好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)更換其它耗材時(shí)，同樣獲得不理想的結(jié)果等。遇到上述狀況時(shí)，有時(shí)研究人員往往會(huì)很困惑，這是什么原因造成的？如何解決呢？

我們不禁要問(wèn)，難道我們?cè)O(shè)計(jì)和合成引物時(shí)推薦的退火溫度不夠準(zhǔn)確嗎？為什么還需要摸索適合儀器的退火溫度呢？帶著這些疑問(wèn)，我們首先從PCR儀本身來(lái)了解一下出現(xiàn)上述問(wèn)題的原因。我們知道在PCR儀上設(shè)置的溫度是模塊溫度，但由于受到模塊的材質(zhì)及熱傳導(dǎo)效率、PCR反應(yīng)管的厚度及與模塊貼合的緊密性等因素的影響，模塊的熱能不能100%傳遞到反應(yīng)管中，這就導(dǎo)致了模塊溫度與反應(yīng)管中的溫度的不一致性。例如銀質(zhì)模塊會(huì)比鋁制模塊導(dǎo)熱性能好；薄壁的PCR管比厚壁的導(dǎo)熱性能高；另外，反應(yīng)管與模塊的貼合的緊密程度來(lái)看，貼合越緊密導(dǎo)熱性能越好。圖中顯示出反應(yīng)管與模塊之間存在一定的間隙這種情況會(huì)導(dǎo)致一定的熱量損失（圖1）。所以出現(xiàn)上述狀況的原因是由于模塊溫度與樣品溫度的不一致性造成的。

圖1. 模塊與反應(yīng)管貼合示意圖

那究竟模塊溫度與樣品溫度存在多大差異呢？我們對(duì)PCR反應(yīng)時(shí)模塊溫度與樣品內(nèi)部溫度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，并繪制出標(biāo)準(zhǔn)PCR儀的溫度曲線（圖2）。從圖中我們可以看出，變性溫度（95℃）下降到退火溫度這個(gè)過(guò)程時(shí)，模塊溫度與樣品溫度逐漸出現(xiàn)差異。當(dāng)三種模塊（Block55/53/57）分別下降到退火溫度時(shí)，模塊溫度會(huì)進(jìn)入平臺(tái)期，此時(shí)樣品溫度與模塊溫度出現(xiàn)如下的差異：當(dāng)模塊溫度進(jìn)入平臺(tái)期5秒鐘時(shí)，樣品與模塊溫度相差6.2℃；10秒鐘時(shí)相差3.0℃；15秒時(shí)相差1.5℃。由于樣品溫度要達(dá)到模塊溫度會(huì)出現(xiàn)一定的延遲，所以為解決這種延遲我們往往需要進(jìn)行梯度PCR實(shí)驗(yàn)，摸索出適合儀器的退火溫度。

圖2. △T = Temp.-difference between block setting and real sample temp.

但即使我們通過(guò)梯度PCR摸索出適合儀器的退火溫度后，在實(shí)際應(yīng)用中仍需要再次進(jìn)行梯度PCR。這主要是由于進(jìn)行不同的PCR實(shí)驗(yàn)和使用不同儀器和/或耗材進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，模塊溫度與樣品溫度差異的不確定性所造成的。這樣我們就能夠了解進(jìn)行梯度PCR的原因：不是由于獲得退火溫度理論值不準(zhǔn)確，而是由于模塊溫度與樣品溫度的不一致性所造成。

眾所周知，引物的退火溫度可通過(guò)以下公式幫助您選擇合適的溫度：Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)，退火溫度=Tm值-(5～10℃)。因此，對(duì)于每一個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)都有一個(gè)理論的退火溫度值。如果PCR儀能夠保證較高的熱傳導(dǎo)效率，就可以保證模塊溫度與樣品溫度保持高度的一致性。這樣我們就無(wú)需進(jìn)行梯度PCR實(shí)驗(yàn)，只需使用退火溫度的理論值即可獲得理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如圖3所示，可以看出這種PCR儀的模塊溫度和樣品溫度保持較好的一致性。當(dāng)模塊進(jìn)入退火溫度平臺(tái)期5秒鐘時(shí)，樣品與模塊溫度僅差0.5℃；10秒時(shí)相差0.3℃；15秒時(shí)相差0.15℃。所以這臺(tái)PCR儀設(shè)置的退火溫度便可以如實(shí)地反映出樣品溫度。

圖3. △T = Temp.-difference between block setting and real sample temp.

綜上所述，種種的問(wèn)題主要是由于熱傳導(dǎo)效率的不同而導(dǎo)致樣品溫度和模塊溫度的差異以及這種差異的不確定性所造成的。梯度PCR摸索出的條件只有在PCR實(shí)驗(yàn)、儀器、試劑和耗材等絕對(duì)一致時(shí)才是有效的，否則任何一個(gè)組成要素的改變又會(huì)帶來(lái)新的不確定性。顯然要徹底解決以上問(wèn)題，研究人員需要一款能夠?qū)崿F(xiàn)高效率的熱能傳導(dǎo)，并保持模塊溫度與樣品溫度高度一致的PCR儀來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。這時(shí)我們無(wú)需梯度PCR就可以解決模塊和樣品之間存在的溫度差異及差異的不確定性等諸多問(wèn)題，同時(shí)這也大大簡(jiǎn)化了PCR程序，更加省時(shí)、省試劑！