表觀遺傳學(xué)和基因組學(xué)研究都是近年來十分熱門的研究方向， 隨著基因組學(xué)的發(fā)展，表觀遺傳學(xué)的研究也開啟了一個新的研究領(lǐng)域：表觀基因組學(xué)研究。這一研究領(lǐng)域利用新一代測序平臺為基礎(chǔ)，結(jié)合經(jīng)典的表觀遺傳學(xué)方法，分析各種表觀遺傳修飾。近期來自中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的研究人員，與深圳華大基因合作，利用基因組DNA甲基化檢測黃金方法Bisulfite Sequencing (BS-Seq)，對黃曲霉全基因組DNA甲基化進(jìn)行了測序，首次證明黃曲霉是一種缺乏DNA甲基化的生物。

 

   這是在世界上第一次使用黃金標(biāo)準(zhǔn)方法—Bisulfite Sequencing研究曲霉屬真菌全基因組DNA甲基化狀態(tài)的報道，也是第三種被證實的缺乏DNA甲基化的生物（前兩種分別是果蠅和面粉甲蟲）。為了更深入的了解這一重要的表觀基因組學(xué)研究成果，生物通特聯(lián)系了中山大學(xué)賀竹梅教授研究組，就讀者感興趣的問題請教了賀竹梅教授和他的研究生林劍青同學(xué)。

 

什么是BS-Seq測序方法？

 

   這項研究采用了目前公認(rèn)的基因組DNA甲基化檢測黃金方法――BS-Seq測序方法，對黃曲霉全基因組DNA甲基化進(jìn)行了測序，并從基因進(jìn)化和基因組序列差異的角度對黃曲霉缺乏DNA甲基化的機(jī)制進(jìn)行了分析，那么這種測序方法具有哪些優(yōu)點呢？研究組為何選擇了這種方法呢？

 

   林劍青同學(xué)表示，“Bisulfite處理測序是目前公認(rèn)的對DNA甲基化狀態(tài)進(jìn)行分析的黃金標(biāo)準(zhǔn)。其原理是，對DNA進(jìn)行Bisulfite處理之后，DNA中未甲基化的胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（U），而甲基化的C則保持不變。對處理轉(zhuǎn)化之后的產(chǎn)物進(jìn)行高通量測序，并與未經(jīng)Bisulfite處理的原始基因組序列進(jìn)行分析比較，從而獲得整個基因組DNA甲基化狀態(tài)的信息。

 

   這是一種覆蓋度、分辨率、可靠性都很高的方法，理論上可以獲得整個基因組上每一個C位點的甲基化信息。在本研究中，我們使用的是基于新一代測序技術(shù)Bisulfite處理測序技術(shù)路線。相比較，之前基于Sanger測序平臺Bisulfite處理測序方法，需要大量的克隆測序，繁瑣費(fèi)時并且價格昂貴，因此，這種方法僅僅被用于研究局部區(qū)域的DNA甲基化，而不能用于全基因組DNA甲基化研究。其次，使用新一代測序平臺之后，Bisulfite處理測序不再需要像基于Sanger測序平臺Bisulfite處理測序一樣設(shè)計大量的擴(kuò)增引物和進(jìn)行大量的PCR擴(kuò)增，而僅需要在打斷的DNA片段兩端連接上測序引物即可上機(jī)測序，而該引物同時也作為DNA樣品的擴(kuò)增引物，其作用就相當(dāng)于在DNA樣品中加入任意擴(kuò)增引物，避免繁瑣的擴(kuò)增引物設(shè)計和PCR擴(kuò)增工作?！?/SPAN>

 

   表觀遺傳學(xué)是目前生命科學(xué)研究的前沿，不僅僅在真菌，其在動物發(fā)育、植物育種、人類健康等方面的研究也得到很多科學(xué)家的關(guān)注，包括DNA甲基化、組蛋白修飾、microRNA等多個方面， 賀教授實驗室這幾年重點關(guān)注了真菌的DNA甲基化現(xiàn)象。

 

   經(jīng)過多年的發(fā)展，目前世界上研究DNA甲基化的技術(shù)手段已經(jīng)相對比較成熟，從比較簡單的DNA甲基化敏感內(nèi)切酶、甲基化敏感特異性PCR擴(kuò)增、HPLC、2D-TLC，到比較先進(jìn)的甲基化芯片的應(yīng)用以及在這項研究中所使用的基于新一代測序技術(shù)的Bisulfite處理測序[1,2]。

 

   林劍青說，“我們在前期的研究中通過DNA甲基化敏感內(nèi)切酶、甲基化敏感特異性PCR擴(kuò)增等方法已經(jīng)發(fā)現(xiàn)黃曲霉DNA甲基化水平極端低，在這種情況下，需要使用一種準(zhǔn)確度和敏感性比較高的研究方法，在整個基因組的范圍內(nèi)對每一個C位點的甲基化狀態(tài)進(jìn)行研究，使我們的研究結(jié)果更有說服力。因此，基于新一代測序技術(shù)的Bisulfite處理測序技術(shù)成了我們的選擇?！?/SPAN>

 

黃曲霉毒素合成代謝，黃曲霉生殖與DNA甲基化的關(guān)聯(lián)

 

   黃曲霉因其產(chǎn)生強(qiáng)致癌物黃曲霉毒素而引起科學(xué)家的重視，黃曲霉毒素合成代謝調(diào)控的研究已成為微生物次生代謝調(diào)控機(jī)制的模型。關(guān)于曲霉屬（Aspergillus）真菌的DNA甲基化問題，已經(jīng)困擾科研工作者多年，從上世紀(jì)80年代初開始，科學(xué)家對曲霉屬真菌的DNA甲基化及其對真菌生長和代謝的影響進(jìn)行了各種研究。

 

   賀教授研究組前期曾采用一種廣泛應(yīng)用于表觀遺傳學(xué)和腫瘤生物學(xué)及真菌次生代謝物研究的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5－氮雜胞苷（5-AC）對黃曲霉毒素代謝的影響進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)5-AC可以誘導(dǎo)黃曲霉產(chǎn)生絨毛狀性狀，同時可以抑制黃曲霉產(chǎn)生黃曲霉毒素的能力。

 

   因此研究人員推測黃曲霉毒素的合成代謝與DNA甲基化存在一定的關(guān)聯(lián)，并由此設(shè)想，如果能發(fā)現(xiàn)一些與DNA甲基化相關(guān)的細(xì)胞因子，那么就有可能發(fā)現(xiàn)能用于黃曲霉毒素代謝的調(diào)控因子，從而使我們對黃曲霉毒素代謝的機(jī)理有新的認(rèn)識并為發(fā)展黃曲霉毒素控制技術(shù)提供新的思路。

 

   “但進(jìn)一步的研究讓我們有點失望，黃曲霉基因組缺乏DNA甲基化，這也使得我們不得不轉(zhuǎn)變對黃曲霉毒素代謝研究的思路”，賀教授說，“從目前的研究來看，黃曲霉毒素的合成代謝與DNA甲基化調(diào)控?zé)o關(guān)。由于黃曲霉毒素的合成代謝是一個相當(dāng)復(fù)雜的事件，雖然其主要的代謝通路已經(jīng)明確，但許多細(xì)節(jié)及代謝基因簇以外的基因的作用、環(huán)境的影響及其他表觀遺傳的調(diào)控還是一個黑洞?！?/SPAN>

 

   除此之外，在另一方面，長期以來，科學(xué)家們都認(rèn)為黃曲霉是一種不具有有性生殖的生物，直到2009年，黃曲霉被發(fā)現(xiàn)是具有有性生殖的[3]。但是，在大部分情況下，黃曲霉還是以無性的方式進(jìn)行生殖。生物的DNA甲基化在有性生殖過程中起著沉默轉(zhuǎn)座子以維護(hù)基因組穩(wěn)定的重要作用[4]?，F(xiàn)存的單細(xì)胞真核生物主要是無性生殖的，因此，缺失通過DNA甲基化沉默轉(zhuǎn)座子的能力很可能更有利于物種的適當(dāng)進(jìn)化。

 

   賀教授說，“結(jié)合我們的研究結(jié)果，我們推測，對于黃曲霉這種主要以無性生殖方式繁殖的生物，DNA甲基化的缺失可能更利于物種的進(jìn)化，在黃曲霉中DNA甲基化可能僅僅存在于其有性生殖的短暫瞬間[2]”?！俺松撤绞?，目前尚無證據(jù)表明DNA甲基化缺失的狀態(tài)與黃曲霉的其他生活習(xí)性或者毒性有直接的關(guān)系，這也是我們的一個意外，還需要更多的研究。”

 

真菌DNA甲基化研究未來發(fā)展

 

   真菌表觀遺傳學(xué)吸引了不少科學(xué)家們的關(guān)注，當(dāng)談到這一領(lǐng)域未來的發(fā)展的時候，賀教授表示，“在基礎(chǔ)研究方面，與動植物相比，真菌這一生物群體的DNA甲基化水平和甲基化分布尤其特殊，因此，DNA甲基化或其他表觀遺傳變異在真菌次生代謝、環(huán)境適應(yīng)以及真菌進(jìn)化中所扮演的角色，將成為未來真菌表觀遺傳學(xué)研究的趨勢。

 

   在應(yīng)用方面，如何通過DNA甲基化或其他表觀遺傳方面的改造，使真菌產(chǎn)生更多的能為人類所利用的代謝物同時抑制有害代謝物的產(chǎn)生，將成為科學(xué)家們關(guān)注的熱點。雖然黃曲霉毒素代謝中存在DNA甲基化調(diào)控的可能性不大，但其他表觀遺傳變異如組蛋白修飾、小分子RNA作用等的調(diào)控作用是值得深入研究的?！?/SPAN>

 

下一步計劃

 

   我們目前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)黃曲霉是一種缺乏DNA甲基化的物種，因此，DNA甲基化與黃曲霉毒素合成代謝存在直接聯(lián)系的可能性比較小。然而，確實有一些證據(jù)表明黃曲霉在表觀遺傳層面對黃曲霉毒素生物合成過程具有調(diào)控作用。

 

   因此賀教授下一步將通過各種技術(shù)手段，進(jìn)一步探究各種表觀遺傳現(xiàn)象如組蛋白修飾、microRNA等在黃曲霉毒素代謝中所扮演的角色。

 

   賀教授說，“我們實驗室在上一個國家基金的資助下對黃曲霉毒素代謝與胞內(nèi)氧化應(yīng)激的關(guān)聯(lián)進(jìn)行了研究，也發(fā)現(xiàn)了一些有趣的現(xiàn)象，我們也將會在基因組層面如利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法等繼續(xù)對黃曲霉毒素代謝調(diào)控的機(jī)制作進(jìn)一步的探索?！?/SPAN>