盡管當(dāng)前有多種方法可用于全面研究蛋白質(zhì)編碼基因的細(xì)胞內(nèi)作用，然而用于系統(tǒng)研究與多種生物學(xué)信號通路有關(guān)的長鏈非編碼RNAs (lncRNAs)的技術(shù)卻十分有限。在這篇文章中，來自德國德累斯頓工業(yè)大學(xué)的研究人員開發(fā)了一種結(jié)合非編碼RNAs敲除和定位分析的技術(shù)，稱之為c-KLAN。利用這一技術(shù)對lncRNAs進(jìn)行了功能鑒定和定位，并鑒別出了調(diào)控小鼠胚胎干細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)錄物。

在真核生物基因組中大量的蛋白質(zhì)編碼和非編碼轉(zhuǎn)錄物被轉(zhuǎn)錄，然而直到近年來后者才獲得廣泛的科學(xué)關(guān)注。LncRNAs是一類非蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄物，長度在幾百bp到幾kb之間。 眾所周知其參與了多種生物學(xué)過程，例如X-染色體失活、染色質(zhì)水平的表觀遺傳學(xué)狀態(tài)調(diào)控、胚胎干細(xì)胞狀態(tài)維持、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及疾病狀態(tài)調(diào)控等。盡管利用標(biāo)記和成像技術(shù)結(jié)合功能缺失研究已成功地應(yīng)用于大量的蛋白質(zhì)編碼基因研究中，卻還沒有關(guān)于長鏈非編碼轉(zhuǎn)錄物顯像和表型特征鑒定的類似方法被報(bào)道。核酸內(nèi)切酶切割制備的短干擾RNAs （endoribonuclease?prepared short interfering RNAs，esiRNAs）已被證實(shí)更加適合于RNAi篩選，因?yàn)樗鼈兡軌蛴行У厍贸邢蜣D(zhuǎn)錄物，又避免了天然復(fù)雜的siRNAs的顯著脫靶效應(yīng)。研究人員認(rèn)為相同的優(yōu)勢同樣適用于沉默lncRNAs。

在這篇文章中，研究人員構(gòu)建了一個(gè)能靶向594種lncRNAs的esiRNA文庫，在小鼠細(xì)胞中進(jìn)行了功能缺失篩查。同時(shí)，研究人員還改良了esiRNA合成方法，實(shí)現(xiàn)了無縫、可再生合成特異性探針檢測了細(xì)胞中lncRNAs的定位。

IncRNAs的esiRNAs和RNA FISH探針的合成路線

步驟：對lncRNA序列進(jìn)行DEQOR優(yōu)化和經(jīng)由電腦模擬設(shè)計(jì)引物，隨后對cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，完成對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測序和定量檢測。接下來一方面通過體外轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增產(chǎn)物生成dsRNA，然后利用Rnse III酶切就生成了可用于IncRNAs功能缺失研究的esiRNA文庫。另一方面可利用鏈特異性RNA聚合酶和熒光標(biāo)記UTPs對PCR進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，即可生成正義或反義探針。然而采用FISH技術(shù)對IncRNAs進(jìn)行定位分析。

利用c-KLAN研究了Panct1在小鼠ESCs中的作用

研究人員利用c-KLAN揭示了小鼠胚胎干細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄物Panct1的定位和功能。證實(shí)Panct1主要定位于細(xì)胞核中，其在ESC狀態(tài)維持中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。

lncRNA生物學(xué)的快速發(fā)展需要對這些轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行深入的檢測，但由于轉(zhuǎn)錄組的復(fù)雜性和適當(dāng)注解的局限性很難對這些轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行標(biāo)記。在此項(xiàng)研究中，科研人員介紹了一種組合方法可大規(guī)模地對lncRNAs進(jìn)行定位和功能分析。c-KLAN為我們提供了一種快速、簡便和可靠的途徑檢測lncRNA介導(dǎo)的各種細(xì)胞過程的調(diào)控。