單分子DNA測序取得重要新進展——基于磁鑷的測序檢測技術

生物通報道：與以往將熒光標記核苷酸加入到DNA分子，進行直接檢測觀察不同，來自巴黎第七大學的丁方圓（Fangyuan Ding，音譯）等人研發(fā)出了一種能檢測DNA發(fā)夾分子長度變化的新技術（具體流程見下圖）。相關成果公布在Nature Methods雜志上。

如果磁珠相對較大，研究人員就能直接通過簡單配有攝像系統(tǒng)的顯微鏡，直接成像。當引入磁場時，發(fā)夾結構被拉伸，解構成一條DNA單鏈。當關閉磁場的時候，發(fā)夾結構就能重新折疊形成。隨著磁珠在聚焦點之內和之外漂移，研究人員就能觀測到衍射環(huán)，從而精確測量磁珠與玻璃表面的距離。

這樣就將十分困難的光學問題（檢測來自單熒光分子的光信號）化難為簡，變成了在亮視場照明下檢測微米級磁珠，從而大大的簡化了光學設備，只需檢測幾種核苷酸順序的長度變化，從DNA發(fā)夾到一堿基長的距離。

但是從這種發(fā)夾長度變化中如何能讀出一條DNA鏈的序列呢？

研究人員探索了幾種方法，首先是雜交測序：當研究人員將一個探針與開發(fā)發(fā)夾結構雜交時，發(fā)夾結構就無法完全折疊，這樣就能精確測量到雜交探針的位置。因此當用大量探針一個接一個雜交時，序列就能通過探針重疊的區(qū)域讀出來。同時用一套小一些的探針能指紋化DNA序列，比如用于病原體的檢測。

然而也許連接綁定測序更為合適，這個概念目前已經(jīng)在Life Technology公司的SOLiD測序儀中實現(xiàn)商業(yè)化了。而在最新這篇文章中，則是指將引物通過結合一個短簡并核苷酸片段進行一步擴增，這種擴增首先是與腺嘌呤為首的片段進行反應，這時只有當對應DNA鏈上的下一個核苷酸是胸腺嘧啶的時候才能進行連接。之后是胞嘧啶為首的片段，再然后是鳥嘌呤和胸腺嘧啶，重復這一周期。

在每次連接之后，磁場都會被關閉，從而測量擴增引物的長度。連接上的引物擴增七個堿基，這明顯拉大了表面和磁珠之間的距離，從而能檢測到。接下來連接片段會在位置2上被清楚，這是為了下一輪做準備，以便下一次連接能緊跟在前一輪的前面。

新一代測序技術（即第二代測序技術），包括來自Roche，Life Technologies，以及Illumina等廠家在內的產品，主要是基于檢測克隆DNA。但是這些系統(tǒng)的讀長受到限制——每一個化學循環(huán)過程中，上千個拷貝中總有一些不可避免會無法得到擴增，從而造成失真和錯誤累積，最長讀長目前少于1kb，一般都在100個堿基左右。

相反真正的單分子測序方法則未受到這種影響，新技術能簡單排除失誤擴增，而錯誤結果也與讀長無關。實際上目前來自Pacific Biosciences的RS 測序儀已經(jīng)能達到幾千bp的長度了，但是也存在缺點：較高的錯誤率，這部分是由于單分子熒光信號難以捕捉的問題。

因此這篇最新文章的重要性就由此凸顯出來，這種分析單分子的方法無需任何實質上的單分子光學檢測，因此也無需其它系統(tǒng)配備的昂貴的高靈敏度光學儀器。