作為第六種堿基，5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）近年來(lái)受到了廣泛的關(guān)注。盡管這種堿基的確切功能仍在研究中，但普遍認(rèn)為它參與了DNA去甲基化或基因表達(dá)調(diào)控。若要了解5-hmC的生物學(xué)功能，研究人員必須清楚它在基因組中的位置。為此，劍橋大學(xué)和Babraham研究所的研究人員開(kāi)發(fā)出一種新技術(shù)，能定位基因組中單個(gè)位點(diǎn)上的5mC和5hmC。該成果于4月26日發(fā)表在《Science》在線版上。

5-hmC是5-mC的羥基化形式，1952年在噬菌體DNA中首次發(fā)現(xiàn)。幾十年來(lái)，羥甲基胞嘧啶的研究一直圍繞著它對(duì)于噬菌體DNA的保護(hù)作用。直至近兩年，研究人員才發(fā)現(xiàn)它在人和小鼠大腦以及胚胎干細(xì)胞中廣泛存在，可通過(guò)TET家族的酶對(duì)5-mC的氧化而產(chǎn)生。5hmC與5mC的關(guān)系可能影響了干細(xì)胞的分化和發(fā)育。鑒于這一重要性，確定5hmC在基因組中的定位可能對(duì)癌癥、神經(jīng)生物學(xué)以及生物學(xué)的其他方面有著非同尋常的意義。

亞硫酸氫鹽測(cè)序是發(fā)現(xiàn)基因組中5mC的標(biāo)準(zhǔn)方法，但它無(wú)法區(qū)分5mC和5hmC。因此，劍橋的化學(xué)家Shankar Balasubramanian及其同事在尋找一些化學(xué)反應(yīng)，希望能改變其中一個(gè)核苷酸，讓它們?cè)跍y(cè)序中以不同的形式讀取。

他們采用的新方法在5hmC上添加了一個(gè)氧原子，這導(dǎo)致其轉(zhuǎn)化成另一個(gè)修飾的核苷酸，5-甲氧基胞嘧啶（5fC）。在進(jìn)入亞硫酸氫鹽的測(cè)序步驟時(shí)，這種新的核苷酸轉(zhuǎn)化成尿嘧啶。而額外的氧化步驟對(duì)5mC無(wú)影響，這樣研究人員就能區(qū)分基因組中這兩種核苷酸。

為了檢驗(yàn)氧化反應(yīng)是否只針對(duì)5hmC，研究人員將三條合成的雙鏈DNA（包含胞嘧啶C、5mC或5hmC）暴露在高釕酸鉀（KRuO4）中，之后開(kāi)展亞硫酸氫鹽測(cè)序。實(shí)驗(yàn)表明，5mC和胞嘧啶未轉(zhuǎn)化成尿嘧啶，而5hmC確實(shí)轉(zhuǎn)化成尿嘧啶。

之后，研究小組利用氧化過(guò)程來(lái)靶定小鼠胚胎干細(xì)胞的基因組DNA中的5hmC。利用氧化和亞硫酸氫鹽測(cè)序過(guò)程，他們高度精確地定位了5hmC。將此結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)亞硫酸氫鹽測(cè)序的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，研究人員確定了5hmC和5mC的精確位置。

Balasubramanian認(rèn)為：“這是首個(gè)以單堿基分辨率對(duì)5hmC和5mC進(jìn)行定量測(cè)序的方法。此方法相當(dāng)簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，并與所有測(cè)序平臺(tái)兼容。倘若是全基因組測(cè)序，主要的成本仍然是測(cè)序?！?/SPAN>

去年，美國(guó)芝加哥大學(xué)與Pacific Biosciences公司的研究人員合作，曾利用第三代單分子測(cè)序技術(shù)和5-hmC的選擇性化學(xué)標(biāo)記方法來(lái)高通量檢測(cè)5-hmC。借助PacBio RS測(cè)序儀，研究人員可直接檢測(cè)DNA甲基化，包括N6-甲基腺嘌呤、5-mC和5-hmC。