來自首爾大學(xué)的研究人員近日在《Genome Research》上介紹了一種精確的基因組改造方法，只在靶位點實現(xiàn)位點特異的基因組修飾，而不會引入不想要的插入缺失。這種方法使用的是鋅指切口酶（nickase），而不是通常所說的鋅指核酸酶。

目前，基因治療領(lǐng)域還存在許多挑戰(zhàn)，從導(dǎo)入到預(yù)防免疫反應(yīng)。然而，最基本的挑戰(zhàn)在于，如何用新鏈來取代現(xiàn)有的DNA鏈，即定向突變。鋅指核酸酶是基因組改造的強大工具，但它依賴DNA雙鏈斷裂的非同源末端連接修復(fù)（NHEJ），此過程容易出錯，在靶位點和脫靶（off-target）位點隨機產(chǎn)生小的插入或缺失（indel）。

韓國首爾大學(xué)的Jin-Soo Kim解釋道：“基因組中通常有許多潛在的脫靶位點，因為人類基因天生是重復(fù)的。如果您意外在那些脫靶位點引入突變，則可能導(dǎo)致癌癥或疾病，因此那些脫靶突變值得關(guān)注?！?/SPAN>

于是，Kim和他的同事開發(fā)出了切口酶，這是一種每次切開單鏈DNA，引入新遺傳物質(zhì)的酶。由于切口酶只切割單鏈，而不是像標(biāo)準(zhǔn)核酸酶那樣切割雙鏈，故不想要的切口可由細(xì)胞內(nèi)部的單鏈斷裂修復(fù)機制快速修復(fù)。

研究小組利用Fok1核酸結(jié)構(gòu)域開發(fā)出切口酶，但經(jīng)過修飾，讓它只引起單鏈斷裂。他們將其放入人胚腎細(xì)胞，來檢驗切口酶的活性。如果它成功將新的DNA整合到細(xì)胞，則細(xì)胞會表達螢光素酶基因。

盡管其他研究小組最近也開發(fā)出自己的切口酶，但Kim的實驗室是第一個研究切口酶對脫靶突變的作用。Kim表示：“我們的數(shù)據(jù)清晰表明，使用這種方法檢測不到脫靶突變?！?/SPAN>

他們也發(fā)現(xiàn)了切口酶的缺點，即在靶位點上的效率略低于核酸酶。這可能是由于單鏈DNA斷裂引發(fā)的同源重組的效率低于雙鏈DNA斷裂引發(fā)的同源重組。他們認(rèn)為，用戶應(yīng)仔細(xì)評估切口酶和核酸酶在特定應(yīng)用上的優(yōu)勢和劣勢。

由于核酸酶介導(dǎo)的同源重組更加高效，故核酸酶仍然是傳統(tǒng)基因knockout和knockin實驗的理想工具。對于干細(xì)胞研究和基因治療等比較關(guān)心脫靶突變的應(yīng)用，切口酶帶來的精確基因組編輯可能更理想。

研究小組計劃下一步研究單鏈斷裂修復(fù)中關(guān)鍵基因的作用，以便提高切口酶的效率。Kim認(rèn)為：“核酸酶已經(jīng)存在了幾十年，并經(jīng)過優(yōu)化。切口酶才出現(xiàn)了幾個月，因此我們?nèi)孕枰獣r間來提高效率。”