觀測RNA可為研究人員帶來許多新的認(rèn)識(shí)。存在于特殊細(xì)胞以及這些細(xì)胞特殊位點(diǎn)中的RNA可以揭示潛藏在差別背后的機(jī)制。在癌癥和其他疾病中，RNA轉(zhuǎn)錄物有時(shí)會(huì)被發(fā)現(xiàn)存在于錯(cuò)誤的地方。“這就是為什么大家會(huì)對RNA的定位感興趣的原因，然而RNA成像一直是一個(gè)挑戰(zhàn)，”威爾康乃爾醫(yī)學(xué)院從事RNA調(diào)控研究的Samie Jaffrey說。

上接：Nature methods：原位RNA成像技術(shù)（一）

van Oudenaarden利用RNA FISH在小鼠腸冰凍切片上顯示了作為三種類型干細(xì)胞標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄物在隱窩中的分布。腸隱窩常被用于研究再生和分化。利用原位RNA，可以快速挑選出大量的標(biāo)記物，組合觀測它們看看哪些獨(dú)特地識(shí)別了不同的細(xì)胞類型；用熒光蛋白標(biāo)記完成同樣的事情將是不太可能或不切實(shí)際的。van Oudenaarden.說：“無需遺傳修飾任何東西，你就可能獲得大量的進(jìn)展。這相當(dāng)?shù)娜菀?。我們開玩笑說我們甚至不是生物化學(xué)家?！彼f難的是設(shè)計(jì)成像系統(tǒng)和相應(yīng)的軟件。

第一個(gè)普遍應(yīng)用的RNA FISH探針是利用質(zhì)粒來生成反義RNA，其摻入的修飾核苷酸結(jié)合到了隨后可以被標(biāo)記的抗體上。阿爾伯特愛因斯坦醫(yī)學(xué)院的Robert Singer實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建出了另一種方法，用酶將熒光核苷酸類似物摻入到長雙鏈DNA分子。他們后來改良了這一技術(shù)利用幾組更小的合成DNA探針，每種探針大約50個(gè)核苷酸長，標(biāo)記著一些小分子熒光基團(tuán)。

這種方法被van Oudenaarden的前博士后Arjun Raj進(jìn)一步改良，他和新澤西醫(yī)學(xué)與牙科大學(xué)的Sanjay Tyagi設(shè)計(jì)出了更短的用于RNA FISH的寡核苷酸。這一系統(tǒng)利用數(shù)組約50種左右的探針，每種靶向轉(zhuǎn)錄物不同的部分。這些探針大約20個(gè)核苷酸長，用單個(gè)熒光基團(tuán)修飾，更易于穿透細(xì)胞，相比于長探針制造更便宜更快速。然而，這種策略不能靶向短于約800個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄物，因?yàn)檩^少標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄物很難看見。

Tyagi說利用更短的、逐個(gè)衍生的探針在固定細(xì)胞中生成RNA標(biāo)記更易于處理?！斑@是一個(gè)簡單的步驟可以解決大問題。由于寡核苷酸合成已經(jīng)變?yōu)樽詣?dòng)化，你可以在96孔板中生成寡核苷酸?！彼a(bǔ)充說更多更小的探針提供了其他的利益。例如，一種探針的結(jié)合松解了轉(zhuǎn)錄物使得其他的探針更易于結(jié)合。并且并不是每個(gè)探針都需要是完美的，“你得到的是所有或大多數(shù)探針結(jié)合的信號，非不是一個(gè)或兩個(gè)錯(cuò)誤結(jié)合的信號?！?/SPAN>

Biosearch Technologies公司在去年9月推出了短的逐個(gè)標(biāo)記的探針Stellaris FISH。在研究人員在線輸入他們需要的轉(zhuǎn)錄物的序列后，公司的軟件會(huì)設(shè)計(jì)出數(shù)組多達(dá)48種探針來標(biāo)記它。Biosearch提供8種熒光基團(tuán)選擇，從藍(lán)色到紅色，研究人員也可以購買為標(biāo)記的衍生探針，自己添加熒光基團(tuán)。例如，van Oudenaarden將特異的基團(tuán)附著到了波譜的紅色端，從而可以與藍(lán)色的核及綠色標(biāo)記的蛋白一并成像。Tyagi在同一套探針內(nèi)利用兩種不同的基團(tuán)檢測了RNA加工事件，例如選擇性剪接形式。相似的方法可以鑒別融合基因。

Biosearch Technologies 公司企業(yè)發(fā)展部主任Marc Beal 說5納摩爾的混合定制寡核苷酸的標(biāo)準(zhǔn)定價(jià)為575美元，足夠進(jìn)行500-2000次反應(yīng)。Beal說該系統(tǒng)可以與各種熒光顯微鏡包括廣野顯微鏡和共聚焦顯微鏡一起使用，可用于冰凍、石蠟包埋組織樣品以及培養(yǎng)細(xì)胞。采用油浸透鏡可將“RNA點(diǎn)”放大60-100倍。Biosearch也正在開發(fā)一種可自動(dòng)分析的專利成像系統(tǒng)。