PacBio第三代測(cè)序技術(shù)在De novo測(cè)序、Target測(cè)序以及DNA Modification等領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛，發(fā)揮的作用也越來越不可替代。而Broad研究院的科學(xué)家們更證明， PacBio RS不僅可以作為基因組研究手段，而且也是極好的基因分型、變異驗(yàn)證與重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平臺(tái)（第三代測(cè)序：?jiǎn)畏肿訙y(cè)序在基因分型與突變驗(yàn)證中的應(yīng)用）。

最近Nature雜志發(fā)表了一項(xiàng)關(guān)于髓母細(xì)胞瘤外顯子組測(cè)序的研究，在該研究中，麻省理工和哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院的科學(xué)家們利用PacBio平臺(tái)成功對(duì)Illumina Hiseq2000外顯子測(cè)序數(shù)據(jù)中的變異位點(diǎn)進(jìn)行了驗(yàn)證分析。

科學(xué)家們首先用外顯子捕獲平臺(tái)結(jié)合illumina Hiseq2000完成了對(duì)92例髓母細(xì)胞瘤患者病灶/正常對(duì)的測(cè)序，分析出多個(gè)可能的點(diǎn)突變位點(diǎn)，然后利用PacBio平臺(tái)對(duì)48個(gè)外顯子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證分析，最終確認(rèn)了12個(gè)與髓母細(xì)胞瘤相關(guān)的變異，其中在RNA解旋酶基因DDX3X上的突變是以前從未發(fā)現(xiàn)的，為這種疾病的基礎(chǔ)研究和診斷提供了新的Marker。此外，科學(xué)家們對(duì)PacBio驗(yàn)證數(shù)據(jù)與Hiseq2000數(shù)據(jù)的比對(duì)分析也證實(shí)，雖然PacBio單分測(cè)序容易產(chǎn)生較多的indel錯(cuò)誤，但是其中大部分都是隨機(jī)性的，可以通過軟件進(jìn)行修正。

“盡管PacBio SMRT測(cè)序方法有著比較高的indel錯(cuò)誤率，但是利用這個(gè)技術(shù)可以非常容易的對(duì)CTDNEP1基因中的2bp deletion突變與其他隨機(jī)indel突變進(jìn)行區(qū)分和識(shí)別”Illumina Solexa平臺(tái)產(chǎn)生的測(cè)序數(shù)據(jù)多是150bp左右的短片段，需要利用復(fù)雜的生物信息學(xué)分析手段對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾、定位、組裝等分析。而且測(cè)序片段過短容易產(chǎn)生定位錯(cuò)誤等問題，依賴PCR的測(cè)序方式也會(huì)不可避免的引入系統(tǒng)性測(cè)序誤差從而產(chǎn)生較多的假陽性。因此，一般需要利用另一種準(zhǔn)確度更高的方法對(duì)其產(chǎn)生的變異數(shù)據(jù)進(jìn)行交叉驗(yàn)證。Sequenom質(zhì)譜法和Sanger測(cè)序方法無疑是驗(yàn)證的金標(biāo)準(zhǔn)，不過質(zhì)譜法無法探尋未知位點(diǎn)，Sanger測(cè)序通量低又容易引入人為誤差。PacBio RS測(cè)序技術(shù)具有單分子的分辨率，不引入PCR過程，其CCS測(cè)序模式所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度非常高，可以對(duì)基因組中的低頻變異進(jìn)行高效的釋讀，而且單分子測(cè)序的讀長(zhǎng)長(zhǎng)，可以尋找除已知位點(diǎn)以外的其他漏檢稀有突變，有效彌補(bǔ)Sequenom和Sanger方法的缺陷。