多重PCR能夠在提高通量的同時節(jié)省樣品降低成本，它需要耗費更多的時間和精力，同時也會給用戶回報更豐富的數(shù)據(jù)。本文介紹了一些實驗技巧和商業(yè)化工具，希望能幫您輕松獲得好結(jié)果。

（上接：攻克多重 PCR之難上篇）

原則三、四、五：優(yōu)化dNTP、MgCl2、聚合酶和鹽的濃度

現(xiàn)在剩下的就是調(diào)整反應(yīng)條件了。要一次進行這么多種反應(yīng)，我們當(dāng)然不想在反應(yīng)中缺了哪個組分。一般多重PCR需要更多的dNTP、鎂離子和聚合酶。Nichols推薦使用0.3 mM dNTP（而非標(biāo)準(zhǔn)的0.2 mM）、2.5 mM Mg2+（而非1.2至2 mM）以及每50μL反應(yīng)體系5 units聚合酶（而非1.25 units）。最后再試試鹽濃度，“在優(yōu)化的時候，增加鹽總會有幫助，尤其能增加特異性?！?/SPAN>

PCR master mix含有緩沖液、鹽、dNTP、Mg和聚合酶，如果我們使用常規(guī)1.25× 或1.5×的PCR master mix就已經(jīng)差不多做到了上述原則的三至五。另外，您還可以選用轉(zhuǎn)為多重PCR優(yōu)化的產(chǎn)品，例如NEB的多重PCR 5× Master Mix、Bio-Rad的iQ™ Multiplex Powermix、或者安捷倫的Brilliant Multiplex QPCR Master Mix。

據(jù)安捷倫的Mason介紹，Brilliant Multiplex QPCR Master Mix是經(jīng)過專門設(shè)計的，能夠很好的解決同一管中不同反應(yīng)相互競爭的問題。如果一個目標(biāo)片段出現(xiàn)1000次，而另一個目標(biāo)片段只出現(xiàn)了10次，那么后一個片段就很容易淪為背景?！拔覀兊亩嘀?/SPAN>PCR試劑盒能夠在同一個管中準(zhǔn)確定量低豐度和高風(fēng)度的目標(biāo)片段，克服偏向性，”Mason說。

我能擴多少目標(biāo)片段一般來說，最多能在同一個管中同時檢測到五個目標(biāo)片段，這既是出于引物設(shè)計的考慮，也是由多重定量PCR的硬件條件決定的。實時熒光PCR儀通常最多檢測4至5個顏色通道，其中一個可能還要留作參考通道。凝膠電泳雖然不受此限制，但多引物一同作用仍然存在困難，因此還是最多達到五重PCR。 “設(shè)計更多是極具挑戰(zhàn)性的，”Cockrum說。

多重定量PCR的染料能進行多重定量PCR的儀器包括：Life Tech公司的QuantStudio™ 12K Flex Real-Time PCR System、安捷倫公司的Mx30005P等等。據(jù)Cockrum介紹，Bio-Rad公司的CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System具有五個通道，每個通道配有單獨的激發(fā)光源和檢測器。在典型配置中，通道1用于FAM，通道2用于HEX或VIC，通道3用于Texas Red或ROX，通道4用于Cy5，通道5用于Quasar 705。目前最流行的選擇是HEX、FAM和VIC，而FAM/HEX和FAM/VIC是用的最普遍的。Life Tech除了生產(chǎn)VIC外，近期又發(fā)布了兩個新染料ABY和JUN以及一個新passive reference dye——Mustang Purple。

Cockrum建議將染料強度與模板豐度結(jié)合起來，用最亮的染料（通常是FAM）配最少的模板，用最黯淡的染料（例如Cy5或Quasar 705）配豐度最高的模板（如看家基因）。

更多重的PCR當(dāng)然，引物設(shè)計是多重PCR的最大障礙，不過一旦克服了這一障礙我們就能進行更多重的PCR反應(yīng)。安捷倫的MassCode技術(shù)就能夠超越定量PCR儀帶來的硬件限制，安捷倫公司將這一技術(shù)推薦給那些想要同時篩選十個以上目標(biāo)片段的用戶，例如可以用來檢測病原體。

MassCode技術(shù)融合了多重PCR和LC/MS技術(shù)。首先，開展多重PCR，每個引物都帶有一個化學(xué)標(biāo)簽（tag）。隨后純化PCR產(chǎn)物，并上樣到LC/MS系統(tǒng)中，切除標(biāo)簽用質(zhì)譜儀進行檢測。2011年，安捷倫公司的科學(xué)家就進行了14重反應(yīng)，對多種沙門氏菌進行檢測和分型。

引物設(shè)計軟件怎樣設(shè)計能夠相互兼容的引物呢？簡而言之，用軟件。現(xiàn)在市面上有很多免費的引物設(shè)計軟件，例如IDT公司的RealTime PCR calculator。Nichols選擇的是Primer3 (MIT, Cambridge, MA)，隨后通過UCSC Genome Browser再次篩選潛在的引物序列，以避免脫靶。

此外，也有不少商業(yè)化工具可供選擇，例如Premier Biosoft家的Beacon Designer（Bio-Rad公司有提供哦）。這個軟件能夠通過全基因組BLAST搜索來避免重復(fù)序列，通過結(jié)構(gòu)預(yù)測來避免高度折疊區(qū)域，通過配對測試來剔除可能的引物二聚體。據(jù)該公司介紹，這一軟件能夠大大幫助多重PCR的引物設(shè)計，從上百萬種潛在組合中挑選出少量符合標(biāo)準(zhǔn)的引物呈獻給用戶，以便用戶進行實驗驗證。

多重PCR能夠在提高通量的同時節(jié)省樣品降低成本，它需要耗費更多的時間和精力，同時也會給用戶回報更豐富的數(shù)據(jù)。如果您有興趣進行多重PCR，那么希望本文中介紹的技巧和產(chǎn)品能夠使您的實驗更輕松，得到更好的結(jié)果。