雙光子顯微鏡在實驗生物學中正變得越來越有必要。其應用范圍包括追蹤細胞和亞細胞的運動，監(jiān)控稀有事件，并記錄小型結構的高速信號。神經(jīng)元樹突和樹突棘很小，而神經(jīng)電生理信號又很快，如膜電位或離子濃度的瞬變，這使得這些結構的功能研究必須使用高時空分辨率的記錄方法。

在這方面，傳統(tǒng)的雙光子顯微鏡，再加上對生理參數(shù)敏感的熒光指示劑，只提供了部分解決方案，帶來了近衍射極限的空間分辨率。這是因為，傳統(tǒng)的雙光子顯微鏡使用相對較慢的束掃描方法，它嚴重限制了功能數(shù)據(jù)可被記錄的程度。

在這篇protocol中，作者詳細介紹了高速雙光子成像系統(tǒng)的發(fā)展，并討論了在選擇附加部件時必須考慮的重要因素。作者提到，大部分高速雙光子成像系統(tǒng)在光學設計上類似于傳統(tǒng)的系統(tǒng)，包含四個主要的部件：光源、掃描儀、顯微鏡和檢測器。不過，這些部件的選擇主要取決于所使用的掃描技術。

在任何細胞中，RNA種類的數(shù)目都是非常復雜的。RNA的大小從20 nt到幾kb不等，且豐度也差異很大，每個細胞中可能只有幾個拷貝，也可能有幾十萬個拷貝。如今大家對于RNA的興趣日益濃厚，希望了解特定RNA物種的豐度和完整性。

這篇protocol介紹了一種檢測小RNA的新方法：夾板連接法（splinted ligation）。它的原理是：在互補的“DNA夾板”或“橋梁”寡核苷酸存在時，依靠T4 DNA連接酶將RNA分子的末端3’-羥基與DNA鏈經(jīng)過標記的5’-磷酸基團相連，之后可通過變性凝膠電泳和磷屏掃描來觀察。這種方法建議用于特定小RNA（如miRNA和piRNA）的常規(guī)檢測和定量。

作者認為，這種方法在檢測小RNA上比northern blotting要靈敏得多，且操作更快。同時，它也是定量的，可用于比較不同樣品中小RNA表達的水平。