為了更清楚地了解細(xì)胞內(nèi)正在發(fā)生的事件，科學(xué)家們需要知道數(shù)以千計(jì)蛋白質(zhì)和其他分子的定位。麻省理工學(xué)院的化學(xué)家們現(xiàn)在開發(fā)了一項(xiàng)新技術(shù)，可以標(biāo)記細(xì)胞某一特定區(qū)域中所有的蛋白質(zhì)，從而更準(zhǔn)確地繪制這些蛋白質(zhì)的圖像。

 

領(lǐng)導(dǎo)這一研究的是著名華裔女科學(xué)家、化學(xué)副教授Alice Ting，她曾師從諾貝爾獲得者錢永健，因?yàn)樵跇?biāo)記和觀測活細(xì)胞內(nèi)特異蛋白上所采用的創(chuàng)新技術(shù)而曾獲得多個(gè)行業(yè)大獎(jiǎng)，包括NIH“院長先鋒獎(jiǎng)”。

 

在這篇發(fā)表于1月31日《科學(xué)》（Science）雜志上的論文中，Ting和同事們利用這一新技術(shù)鑒別了定位在線粒體基質(zhì)上的近500個(gè)蛋白質(zhì)。

 

Ting說：“能夠獲得活細(xì)胞時(shí)空分辨分子圖像，這是生物學(xué)的一個(gè)圣杯。我們離這一目標(biāo)仍然很遠(yuǎn)，但我們最主要的動(dòng)機(jī)還是為了更接近于這一目標(biāo)。”

 

Ting與來自Broad研究所和哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究人員共同開發(fā)的這項(xiàng)新技術(shù)，結(jié)合了現(xiàn)有兩種技術(shù)——顯微鏡成像和質(zhì)譜法的力量，標(biāo)記了細(xì)胞特異區(qū)域中的蛋白質(zhì)，生成了一張?jiān)搮^(qū)域中所有蛋白質(zhì)的綜合列表。

 

蛋白標(biāo)記

 

利用熒光顯微鏡或電子顯微鏡，科學(xué)家們可以高分辨率確定蛋白質(zhì)定位，但一次只能對少量細(xì)胞的約2萬個(gè)蛋白進(jìn)行成像。Ting說：“這是一個(gè)容量問題。你當(dāng)然不能在單細(xì)胞中一次對蛋白質(zhì)組中的所有蛋白質(zhì)成像，因?yàn)闆]有辦法從光譜上分開大量信號(hào)通道?！?/SPAN>

 

利用質(zhì)譜法，通過電離檢測化合物的質(zhì)量和化學(xué)結(jié)構(gòu)，科學(xué)家們可以在一次實(shí)驗(yàn)中分析單個(gè)細(xì)胞的整個(gè)蛋白質(zhì)組成。然而，這一過程需要溶解細(xì)胞膜釋放細(xì)胞內(nèi)容物，它將所有蛋白質(zhì)混雜到了一起。通過純化這些混合物，并提取特異的細(xì)胞器，就有可能弄清這些細(xì)胞器中的蛋白質(zhì)，但這一過程很麻煩，且常常是不可靠的。

 

新方法則是在質(zhì)譜法之前先標(biāo)記活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，從而在細(xì)胞裂解之前先獲得了空間信息。隨后在分析過程中通過注釋攜帶定位標(biāo)記的蛋白，對這一信息進(jìn)行重建。

 

新系統(tǒng)利用了一種生物素（biotin）化學(xué)標(biāo)記。為了用生物素標(biāo)記蛋白質(zhì)，研究人員首先設(shè)計(jì)出了一種命名為“APEX”的新酶。該酶是一種過氧化物酶。

 

每種過氧化物酶都具有不同的底物，生物素酚（biotin-phenol ）是APEX的一種底物。當(dāng)研究人員將生物素酚添加到表達(dá)APEX的工程細(xì)胞上時(shí)，該酶生成了生物素-苯氧自由基(phenoxyl radical)——帶有不成對電子的高活性分子。這些自由基迅速抓取附近的蛋白質(zhì)，用生物素對它們進(jìn)行標(biāo)記。

 

為了確定生物素是細(xì)胞中特異區(qū)域唯一的標(biāo)記蛋白，研究人員設(shè)計(jì)APEX，使得它只與定位于目的區(qū)域的某一蛋白質(zhì)或肽結(jié)合。一旦處于正確的位點(diǎn)，APEX酶就會(huì)在最初目標(biāo)的短距離內(nèi)標(biāo)記所有其他的蛋白質(zhì)。

 

Ting說，標(biāo)記蛋白質(zhì)之后的過程便非常的常規(guī)。溶解細(xì)胞，提取生物素標(biāo)記蛋白質(zhì)，利用質(zhì)譜法鑒定這些蛋白質(zhì)。

 

“你所做的就是在活細(xì)胞中用生物素標(biāo)記這些蛋白質(zhì)，然后你只需抽提出這些蛋白質(zhì)。因此，你可以繞過與純化蛋白質(zhì)區(qū)域和細(xì)胞器相關(guān)的所有問題，因?yàn)槟阍僖膊恍枰@樣做，”Ting說。

 

綜合列表

 

為了證明這一技術(shù)的效力，研究人員生成了線粒體基質(zhì)上蛋白質(zhì)的綜合列表。細(xì)胞的大部分能量均是在線粒體中生成，許多的生物合成過程也在這一細(xì)胞器中發(fā)生。

 

利用這一新方法，研究小組鑒別了線粒體基質(zhì)中近500個(gè)蛋白質(zhì)。以前，研究人員曾嘗試通過抽提這一細(xì)胞區(qū)室，然后進(jìn)行質(zhì)譜分析，生成了僅37個(gè)蛋白質(zhì)的列表?！皬那安]有線粒體基質(zhì)亞區(qū)的高質(zhì)量圖譜，而現(xiàn)在我們獲得了一個(gè)，”Ting說。她補(bǔ)充說道，這一新的信息資源應(yīng)該有助于生物學(xué)家們了解更多關(guān)于其中大量蛋白質(zhì)功能的信息。

 

該研究小組現(xiàn)發(fā)現(xiàn)，與血紅素合成有關(guān)的PPOX酶并非如生物學(xué)家曾認(rèn)為的那樣定位。當(dāng)血紅素前體通過生物合成途徑時(shí)，它們穿梭到了細(xì)胞的不同部位。在線粒體基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)PPOX表明：一定是有未知的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將血紅素前體帶到了基質(zhì)。

 

她說：“重定位將使得人們不得不重新思考這些生物合成途徑，以及中間體移動(dòng)的機(jī)制?，F(xiàn)在基于我們數(shù)據(jù)，將不得不改寫對這條途徑的分子理解?！?/SPAN>

 

現(xiàn)在，研究人員正在調(diào)查存在于線粒體另一區(qū)室——膜間隙中的蛋白質(zhì)。他們也修改了標(biāo)記系統(tǒng)的化學(xué)物，以便他們能利用利用它來完成其他任務(wù)，例如繪制膜蛋白的表面結(jié)構(gòu)圖譜，檢測特異蛋白質(zhì)間的相互作用。