在論證了利用重組蛋白可鑒定SH2磷酸化蛋白結(jié)構(gòu)域的相互作用后，美國(guó)休斯頓大學(xué)的研究人員開(kāi)始研究在體內(nèi)檢測(cè)磷酸化蛋白質(zhì)相互作用的可行性。

研究人員開(kāi)發(fā)了一種基于細(xì)胞總蛋白測(cè)定法在腫瘤細(xì)胞中檢測(cè)由酪氨酸磷酸化介導(dǎo)的內(nèi)源性磷酸化的蛋白質(zhì)相互作用。他們假設(shè)，在多肽芯片上的酪氨酸磷酸濃度（在pM或fM范圍內(nèi)）比在體內(nèi)的濃度高得多（1–4 µM），這將使磷酸肽能夠捕獲參與磷酸模體的蛋白復(fù)合物。

為了測(cè)試這一假設(shè)，研究人員設(shè)計(jì)了一款酪氨酸磷酸肽芯片(聯(lián)川生物提供多肽芯片技術(shù)服務(wù))，其具有160個(gè)高親和力的SH2結(jié)構(gòu)域，可以結(jié)合之前實(shí)驗(yàn)鑒定的磷酸模體包括重組體SH2結(jié)構(gòu)域。芯片上每條多肽探針設(shè)置了10次重復(fù)，每次重復(fù)設(shè)置了一條質(zhì)控多肽。

為了檢測(cè)并比較GRB2的磷蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，研究人員采用了磷酸肽綁定試驗(yàn)分析了4種不同類(lèi)型的細(xì)胞：

非致瘤性上皮細(xì)胞（MCF10A）

ER陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞（MCF7）

ER陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞（T47D）

乳腺轉(zhuǎn)移性細(xì)胞系（MDA-MB231）

細(xì)胞裂解物結(jié)合實(shí)驗(yàn)方案（a）和預(yù)測(cè)的細(xì)胞總蛋白混合物中相互作用的類(lèi)型，其中蛋白可能通過(guò)各種磷酸酪氨酸結(jié)合域和磷酸酪氨酸模體進(jìn)行相互作用（b）。

掃描芯片后獲得的圖像文件（a），如下圖所示，由酪氨酸磷酸化多肽結(jié)合GRB2介導(dǎo)的蛋白復(fù)合物的絕對(duì)信號(hào)測(cè)定，可通過(guò)GRB2蛋白特異性一抗與隨后結(jié)合染料的二抗進(jìn)行檢測(cè)。

采用內(nèi)部軟件程序?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臄?shù)據(jù)處理，選取與細(xì)胞裂解物中內(nèi)源性GRB2相互作用居前的磷酸肽探針（b）。

共有57個(gè)磷酸化肽探針在不同細(xì)胞類(lèi)型中顯示出顯著的相互作用差異（2–3倍），這足以將一個(gè)細(xì)胞類(lèi)型從另一個(gè)細(xì)胞類(lèi)型中區(qū)分開(kāi)。

幾乎70%的相互作用（40/57）被以前的研究所證實(shí)，而其余的是新的未知的相互作用。這支持了研究者對(duì)濃度介導(dǎo)磷酸肽蛋白復(fù)合物結(jié)合的假設(shè)。

基于Pepcyber數(shù)據(jù)庫(kù)的預(yù)測(cè)，24個(gè)相互作用是由GRB2直接介導(dǎo)的，17個(gè)相互作用或是以直接或是以復(fù)合體形式與其他蛋白相互作用，15個(gè)相互作用是間接與一個(gè)或多個(gè)sandwich蛋白作用，這可能會(huì)在細(xì)胞裂解物中有數(shù)千個(gè)蛋白質(zhì)通過(guò)不同的磷酸酪氨酸模體進(jìn)行相互作用的情況下出現(xiàn)。