基因工程的基本技術(shù)是人工進(jìn)行基因的剪切、拼接、組合?；蚴且欢尉哂幸欢üδ艿腄NA分子，要把不同基因的DNA 線形分子片段準(zhǔn)確地切出來(lái)，需要各種限制性核酸內(nèi)切酶（restriction endonuclease）；要把不同片段連接起來(lái)，需要DNA 連接酶（DNA ligase）；要合成基因或其中的一個(gè)片段，需要DNA 聚合酶（DNA polymerase）等。因此，酶是DNA 重組技術(shù)中必不可少的工具，基因工程中所用的酶統(tǒng)稱為工具酶。

        工具酶就其用途而言可分為三大類：限制性內(nèi)切酶、連接酶和修飾酶，其中限制性內(nèi)切酶為一大類酶（達(dá)上千種）。基因重組正是利用了這些工具酶對(duì)DNA 分子進(jìn)行一系列的酶催化反應(yīng)，才得以在體外實(shí)現(xiàn)DNA 分子的切割和連接。因此，工具酶的發(fā)現(xiàn)為基因操作提供了十分重要的技術(shù)基礎(chǔ)。首先重點(diǎn)介紹限制性內(nèi)切酶（restriction endonucleases＝restriction enzyme），其他酶在相關(guān)內(nèi)容中再一一介紹。

        從分子生物學(xué)發(fā)展歷史看，核酸限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用對(duì)該學(xué)科發(fā)展所起的作用是難以估量的。首先使外源基因在大腸桿菌中克隆的實(shí)驗(yàn)是在1973 年完成的，Stanley Cohen，Herbert Boyer（見補(bǔ)充資料2.1）正是利用了限制性內(nèi)切酶這一分子手術(shù)刀才得以實(shí)現(xiàn)。

        核酸限制性內(nèi)切酶是原核生物中的一類能識(shí)別雙鏈DNA 中特定堿基順序的核酸水解酶。原核生物的限制和修飾系統(tǒng)猶如高等動(dòng)物的免疫系統(tǒng)，依靠一對(duì)識(shí)別相同序列的核酸限制性內(nèi)切酶和甲基化酶活性來(lái)對(duì)抗外來(lái)DNA 的入侵：當(dāng)自身的基因組在復(fù)制完成下輪DNA 復(fù)制尚未開始前就被甲基化酶修飾(使某特定序列甲基化), 避免了被對(duì)應(yīng)的限制性內(nèi)切酶的識(shí)別和水解，而入侵的噬菌體由于未來(lái)得及修飾而被破壞，從而保護(hù)細(xì)菌不受噬菌體的感染。各種細(xì)菌都能合成一種或幾種順序?qū)Ｒ坏暮怂醿?nèi)切酶。這些酶的功能就是通過(guò)特異性序列的識(shí)別后進(jìn)行DNA 的切割，來(lái)限制外源性DNA 侵入自身的細(xì)胞內(nèi)，所以稱這種核酸內(nèi)切酶為限制酶。

        根據(jù)酶的識(shí)別切割序列的特性、催化條件以及是否具有修飾酶的活性而分成三類：I、II、III類：

        第I 類限制性內(nèi)切酶是雙功能酶，具有修飾活性（甲基化）和內(nèi)切酶活性，作用時(shí)需要消耗ATP，能識(shí)別專一的核苷酸順序，并在距離識(shí)別點(diǎn)大約1000 個(gè)核苷酸對(duì)處切割DNA 分子中的雙鏈，但是切割的核苷酸順序沒有專一性，是隨機(jī)的。 (實(shí)驗(yàn)頻道 )

        第II 類限制性內(nèi)切酶只具有核酸內(nèi)切酶活性，能識(shí)別專一的具有回文結(jié)構(gòu)的核苷酸順序，并在該順序內(nèi)的固定位置上切割雙鏈，作用時(shí)不需要水解ATP 提供能量。

        第III 類限制性內(nèi)切酶也同時(shí)具有修飾活性和內(nèi)切酶活性，具有專一的識(shí)別順序，但不是對(duì)稱的回文順序。它在識(shí)別順序旁邊24-26 個(gè)核苷酸對(duì)的固定位置上切割雙鏈，但這幾個(gè)核苷酸對(duì)則是任意的。

        其中II 類酶在基因重組中最有應(yīng)用價(jià)值。因此以下內(nèi)容均以II 類限制性內(nèi)切酶為主。

1．限制性內(nèi)切酶的命名和書寫

        限制性內(nèi)切酶主要是從原核生物中提取的?，F(xiàn)在通用的命名原則是：第一個(gè)字母是細(xì)菌屬名的第一個(gè)字母，第二、三個(gè)字母是細(xì)菌種名的前二個(gè)字母，這些字母都用斜體字書寫；如果同一生物種內(nèi)又分為不同的血清型和菌株，其菌株名稱的第一個(gè)字母，用正體字書寫，并放在限制酶名稱的第三個(gè)字母后面。比如限制酶Hinc Ⅱ和Hind Ⅲ �是分��自流感嗜血菌(Haemophilus influenzae )的c 和d 血清型菌株。如果同一菌株中有幾種不同的內(nèi)切酶時(shí)，則分別用羅馬數(shù)字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……來(lái)代表，如表2.1 所示。

2．限制性內(nèi)切酶的特點(diǎn)：

        ①識(shí)別特定的核苷酸序列：長(zhǎng)度一般為4~6bp 并具有回文結(jié)構(gòu)的順序（palindromes，一段自我互補(bǔ)的DNA 順序，即上下鏈從5’→3’方向所讀的順序完全一樣）。

        ②具有特定的酶切位點(diǎn)：即在識(shí)別序列的特定位點(diǎn)對(duì)雙鏈DNA 進(jìn)行切割，由此產(chǎn)生特定的酶切末端。通常雙鏈DNA 被酶切后可出現(xiàn)三種形式的末端：5’突出的粘末端；3’突出的粘末端；平末端。

        ③由兩種酶分子組成的二元系統(tǒng)：一種是限制性內(nèi)切酶，另一種是甲基化酶，二者識(shí)別位點(diǎn)相同，但后者不是切割，而是對(duì)識(shí)別序列中的一個(gè)堿基進(jìn)行甲基化修飾，該甲基基團(tuán)伸入到雙螺旋的大溝中去，阻礙了限制性內(nèi)切酶的作用，使之不受對(duì)應(yīng)的限制性內(nèi)切酶的切割。對(duì)于原核生物來(lái)說(shuō)，甲基化酶對(duì)其自身DNA 序列進(jìn)行甲基化，使其免受限制性酶的作用，因此甲基化酶是細(xì)菌體內(nèi)的一種保護(hù)機(jī)制。換言之，正是由于限制性內(nèi)切酶與甲基化酶，組成了原核生物的一個(gè)完整的免疫系統(tǒng)。

3．應(yīng)用限制性內(nèi)切酶注意事項(xiàng)：

        酶單位（U）的定義：在50μl 反應(yīng)液中, 37℃保溫1h, 使1μg 的特定DNA 完全分解所需的酶量為1 個(gè)活性單位。由于酶的活性與其所處的反應(yīng)條件有很大的關(guān)系，因此在使用限制性內(nèi)切酶需注意：
①反應(yīng)條件：每種酶所需的最適條件各不相同，包括：溫度、不同的離子濃度、pH、還原劑等，因此為了保證酶處于最佳反應(yīng)條件，每種酶必須備有配套的緩沖系統(tǒng)（buffer）。
②DNA 的純度是影響反應(yīng)效率的主要因素，雜質(zhì)包括：蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、以及高濃度的鹽離子。降低污染的辦法：適當(dāng)增加酶的用量、擴(kuò)大反應(yīng)體積（通過(guò)稀釋降低污染物的濃度），或延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間。 (實(shí)驗(yàn)頻道 )
③注意甘油的濃度(酶儲(chǔ)液)，所提供的緩沖液均為10 倍濃縮液，目的是保證稀釋的酶保存液中甘油的濃度不會(huì)超過(guò)5 %。但較小的反應(yīng)體積更容易受到移液器誤差的影響，因此酶切反應(yīng)體系不宜在體積過(guò)?。ㄈ缧∮?0μl）范圍中進(jìn)行。
④注意反應(yīng)液的充分混合，但不可振蕩。反應(yīng)液充分混合是為了保證反應(yīng)完全，推薦用取液器反復(fù)吸取混合，或是用手指輕彈管壁混合，然后再快速離心即可。

        上述只是一些基本原則，實(shí)際操作中需要綜合考慮。一些大的試劑公司均會(huì)提供各種限制性內(nèi)切酶的詳細(xì)資料。特別強(qiáng)調(diào)的是，并不是酶量越多越好，反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)越好，因?yàn)橄拗菩詢?nèi)切酶都有Star 活性，即發(fā)生非特異性的反應(yīng)（所謂Star activity，是在一些特定的條件下，酶對(duì)底物DNA 的特異性可能降低，以致在識(shí)別序列以外的位點(diǎn)進(jìn)行切割。在甘油含量高、酶量大，有機(jī)溶劑以及鹽濃度低時(shí)容易發(fā)生）；同時(shí)酶在保溫過(guò)程中，活性也會(huì)發(fā)生變化。

        為了能夠正確的利用限制性內(nèi)切酶，應(yīng)該注意閱讀產(chǎn)品說(shuō)明書以及相關(guān)的介紹。例如：各種限制性內(nèi)切酶在保溫過(guò)程中的活性變化表；雙酶切反應(yīng)時(shí)的通用緩沖液使用表；不同緩沖液中各種限制性內(nèi)切酶的活性變化表等等。另外需要注意的是，不同公司產(chǎn)品的酶和緩沖液不要混用。

        在多數(shù)情況下，同一種限制性內(nèi)切酶所產(chǎn)生的DNA 雙鏈末端結(jié)構(gòu)總是相同的，因而用同一種限制性內(nèi)切酶酶切同一個(gè)或兩個(gè)不同來(lái)源的DNA 分子所產(chǎn)生的末端都可以相互配對(duì)，在DNA連接酶的作用下，3＇和5＇末端重新形成磷酸二酯鍵，而成為一個(gè)重組的DNA 分子。

        由于這些限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列都是對(duì)稱的，因而兩個(gè)DNA 片段可以從兩個(gè)不同的方向連接起來(lái)。這種外源DNA 片段的插入沒有一定的方向，這對(duì)插入片段的方向并不顯得重要時(shí)適用，如在構(gòu)建基因文庫(kù)時(shí)。然而在研究基因表達(dá)時(shí)，考慮外源DNA 的插入方向則是十分重要的，需要采取不同的方式進(jìn)行控制，以達(dá)到定向連接的目的。

         雖然不同種的限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的DNA 雙鏈末端結(jié)構(gòu)在大多數(shù)情況下是不相同的，但有些不同種限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的末端卻是相同的，即具有相同類型的突出末端(都是5＇端或3＇端突出)，突出的核苷酸數(shù)目相等且序列也相同，因而可以互相連接起來(lái)。這種由不同種的限制酶產(chǎn)生的能相互連接的末端常稱之為相容性末端，這些酶則稱之為同尾酶（isocaudamer）。

        例如，限制酶BamH I 和 BglⅡ都能識(shí)別各自的6 核苷酸序列，且切點(diǎn)都在同一位置，依次為GGATCC 和AGATCT， 因此產(chǎn)生的DNA 片段都產(chǎn)生一個(gè)相同的單鍵5＇端突出 (突出序列是GATC)。當(dāng)這些酶作用DNA 分子后，它們都能相互連接，但是新形成的DNA 分子將同時(shí)失去這兩種酶的識(shí)別序列。

        通常，不同的限制酶具有不同的識(shí)別序列，但有些不同來(lái)源的酶能識(shí)別相同的序列，這些酶被稱為同裂酶（isoschizomer），不過(guò)其中有些酶具有相同的切點(diǎn)，而有些酶的切點(diǎn)卻并不相同，如Acc Ⅲ與BspEⅠ、BseAⅠ、BsiMⅠ、Bsp 131、Kpn21、MroⅠ識(shí)別序列都是TCCGGA,t 它們的切點(diǎn)都在T 和C 之間，即T/CCGGA；但BbeⅠ與KasⅠ、NarⅠ、SfoⅠ識(shí)別序列都是GGCGCC，但它們的切點(diǎn)分別為GGCGC/C、G/GCGCC、GG/CGCC、GGC/GCC。

        現(xiàn)在已從各種微生物中發(fā)現(xiàn)三千余種限制酶，它們識(shí)別序列的長(zhǎng)度最短的是4 個(gè)核苷酸，最長(zhǎng)的為8 個(gè)核苷酸?；蚩寺∵^(guò)程中使用頻率最高的是識(shí)別6 個(gè)核苷酸的限制酶。這是因?yàn)橛?個(gè)核苷酸組成的識(shí)別序列在DNA分子中出現(xiàn)的頻率很高，如果按完全隨機(jī)分布的原則，每44＝256個(gè)核苷酸可出現(xiàn)一個(gè)相同的4 核苷酸識(shí)別序列。如果是由6 個(gè)核苷酸序列組成的限制酶識(shí)別位點(diǎn)，那么就應(yīng)該有46＝4096 bp才可能出現(xiàn)一次。識(shí)別8 個(gè)核苷酸的限制酶識(shí)別位點(diǎn)就應(yīng)該有48＝65,536 bp才重復(fù)一次。因此，在一個(gè)DNA分子中，識(shí)別4 個(gè)核苷酸的限制酶位點(diǎn)太多，識(shí)別8 核苷酸的限制酶位點(diǎn)又太少。換句話說(shuō)，識(shí)別4 核苷酸的限制酶將DNA切得太短，識(shí)別8 個(gè)核苷酸的限制酶將DNA切得太長(zhǎng)，而識(shí)別6 個(gè)核苷酸的限制酶則比較適中，切下的DNA片段平均長(zhǎng)4.1 kb左右。除此之外，片段過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短，從技術(shù)角度講，操作起來(lái)也不太方便。

        實(shí)際上，任何一種生物基因組的DNA 分子中的核苷酸分布并不是完全隨機(jī)的。也就是不同物種的基因組DNA 中，所含的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的種類和數(shù)量各不相同。也正由于此，可以通過(guò)繪制限制性內(nèi)切酶圖譜來(lái)描述某一個(gè)物種的基因組特征，即物理圖譜。

        *基因組DNA 的總長(zhǎng)度：E.coli，4.6Mb；S.cerevisiae,12.1 Mb；C.elegans，100 Mb；D.melanogaster,3.8 Mb；H.sapiens，22 Mb