PCR產(chǎn)物的克隆

日期：2009-08-13 16:20:34

PCR產(chǎn)物克隆大致分為兩類，即平頭連接和粘頭連接。
平頭連接是將制備好的平頭載體和補(bǔ)平或削平的PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行連接。載體可用EcoR V或Sma I切成平頭；PCR產(chǎn)物純化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用該酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。如果要求不高，PCR產(chǎn)物也可不加處理。如果使用Stratagene公司的pfu DNA聚合酶或New England Biolabs公司的Vent DNA聚合酶，這兩種酶有5’→3’校對能力，擴(kuò)增出來的PCR產(chǎn)物已經(jīng)是平頭，可以不作平端處理。平端連接的一個(gè)顯而易見的缺陷是連接效率低下，即使使用很高單位的連接酶，或在反應(yīng)體系中加入PEG 8000，也只能很有限地提高效率。
粘頭連接也可以大致分為兩類，一類粘頭連接是用某種方法，在載體和PCR產(chǎn)物上產(chǎn)生長的可互補(bǔ)的粘性末端。最普遍的方法是在引物的5’端加入一段某種限制酶的識別序列。如果兩個(gè)引物選用不同的限制性內(nèi)切酶識別序列，就可以做到定向連接。另一類利用部分PCR產(chǎn)物3’端帶有一個(gè)凸出的dAMP的特性，構(gòu)建3’端帶有凸出的dTMP的載體。一般采用的方法是先把載體用某種限制性內(nèi)切酶消化成平頭，在70℃或72℃下在只加入一種dNTP、即dTTP的反應(yīng)體系中用Taq DNA聚合酶處理半小時(shí)（也有人報(bào)道處理1～2小時(shí)能提高克隆效率，這樣加T反應(yīng)會(huì)更徹底）。也可以用末端轉(zhuǎn)移酶來完成加T反應(yīng)。載體自連、PCR產(chǎn)物串連可以忽略。如果使用ddTTP，效果會(huì)更好。這種方法一般稱為加T/A法克隆，比平頭連接效率高50～100倍。
一、PCR產(chǎn)物的TA克隆
1. TA克隆構(gòu)建原理：TA克隆系統(tǒng)由Invitrogen公司（San Diego，CA）發(fā)展而來的商業(yè)性試劑盒，它用于PCR產(chǎn)物的克隆和測序。其原理是利用Taq酶能夠在PCR產(chǎn)物的3’末端加上一個(gè)非模板依賴的A，而T載體是一種帶有3’T突出端的載體，在連接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR產(chǎn)物直接插入到質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)（MCS）中。
2.操作步驟
⑴ 連接反應(yīng)一般在滅菌的0.5ml離心管中進(jìn)行。
⑵ 10μl體積反應(yīng)體系如下：
?、偃載體1μl (50ng)，加入等摩爾數(shù)PCR產(chǎn)物。
②加入含ATP的10×Buffer 1μl，T4 DNA連接酶合適單位，用ddH₂O 補(bǔ)足至10μl 。
⑶ 稍加離心，通常為14-16℃水浴連接8-14hr，或4℃過夜。
⑷ 轉(zhuǎn)染，藍(lán)白斑篩選同前。
二、注意事項(xiàng)
1.要獲得目的基因的TA克隆，PCR產(chǎn)物的特異性要好。
2.PCR產(chǎn)物在TA克隆前要通過純化。
3.在PCR產(chǎn)物回收、純化過程中防止外來DNA污染。