cleaved parp1單克隆抗體制備的步驟方法
日期：2023-05-10 14:46:42
PARP1在DNA修復(fù)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用的蛋白質(zhì)。在細(xì)胞凋亡中，PARP1 被激活的半胱氨酸蛋白酶 caspase3 和 caspase7 水解，導(dǎo)致 PARP1 的 N端被裂解，并釋放出具有死亡啟動(dòng)功能的 24kDa 片段。因此，cleaved PARP1 (裂解的PARP1) 成為了診斷細(xì)胞凋亡的重要分子標(biāo)志物。
單克隆抗體是一種高度特異性、高親和力的蛋白質(zhì)，很適合用于檢測(cè) cleaved PARP1 的表達(dá)。下面將介紹一種制備 cleaved PARP1 單克隆抗體的方法。
1. 免疫原的制備
①收集培養(yǎng)好的人類細(xì)胞，如 HeLa 細(xì)胞。
②將細(xì)胞洗滌并暴露在低滲肝素鹽水（PBS）中。
③使用液氮的冷凍-溶解技術(shù)以及機(jī)械壓碎法來裂解細(xì)胞，得到裂解物的混合物。
④使用蛋白質(zhì)電泳和透析技術(shù)從混合物中純化出 cleaved PARP1，然后用凈化后的蛋白質(zhì)制備成免疫原。
2. 免疫動(dòng)物
①給小鼠注射 cleaved PARP1 免疫原。按照以下方式進(jìn)行注射：首先，將免疫原混合物與免疫佐劑混合，然后經(jīng)皮下、肌肉或靜脈注射到小鼠體內(nèi)。
②在一段時(shí)間內(nèi)反復(fù)注射免疫原，以便免疫系統(tǒng)能夠產(chǎn)生免疫反應(yīng)。殺死小鼠并收集其脾臟，以制備免疫球蛋白。
3. 單克隆抗體制備
①從脾臟細(xì)胞中分離出單個(gè) B 細(xì)胞，該細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生特定的抗體。
②將單個(gè) B 細(xì)胞與癌細(xì)胞融合，得到雜交瘤細(xì)胞。
③將這些雜交瘤細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并篩選出產(chǎn)生免疫球蛋白的雜交瘤細(xì)胞。
④對(duì)產(chǎn)生的免疫球蛋白進(jìn)行鑒定，挑選特異性強(qiáng)、抗原親和力高的雜交瘤細(xì)胞，以制備單克隆抗體。
以上步驟中，免疫原的制備和免疫動(dòng)物的免疫過程可能會(huì)受到多種因素的干擾，從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不準(zhǔn)確。因此，為了獲得更精確、可靠的單克隆抗體，需要在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和操作技術(shù)上進(jìn)行仔細(xì)的考慮和調(diào)整。
