小鼠E-Tag抗體檢測(cè)制備

日期：2023-06-12 14:33:58

小鼠E-Tag抗體是一種廣泛應(yīng)用于免疫印跡、免疫沉淀等實(shí)驗(yàn)中的重要試劑，可用于檢測(cè)蛋白質(zhì)中所攜帶的C-terminal E標(biāo)簽。本文將介紹小鼠E-Tag抗體的制備過(guò)程。

一、抗原制備：
E-Tag是一種典型的C-terminal標(biāo)簽，由8個(gè)氨基酸組成，即DYKDDDDK。首先需要合成E標(biāo)簽肽段，然后將其偶聯(lián)到載體蛋白上，以便制備抗原?？梢允褂枚喾N載體蛋白，如GST、MBP、His-Tag等。將E標(biāo)簽肽段插入載體蛋白基因的N或C端，通過(guò)表達(dá)、純化和與大豆凝集素分離柱層析等步驟制備純化的抗原。

二、免疫小鼠：
將純化的E標(biāo)簽抗原溶液與小鼠進(jìn)行免疫，注射方法可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求和小鼠品系選擇靜脈注射、皮下注射等方式。建議對(duì)小鼠進(jìn)行4-5次免疫，每次間隔2-3周，以盡可能提高免疫效果。為了提高抗體的特異性與純度，建議在最后一次免疫前進(jìn)行預(yù)測(cè)血清抗原酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）以判斷小鼠體內(nèi)抗體含量和特異性。選定最理想的小鼠后，采集其脾細(xì)胞或骨髓進(jìn)行細(xì)胞融合。

三、雜交瘤細(xì)胞制備：
將小鼠脾細(xì)胞與骨髓細(xì)胞進(jìn)行混合，用PEG或電穿孔法將其融合，形成雜交瘤細(xì)胞。將細(xì)胞分配到96孔板中，在含有腎上腺素的RPMI1640培養(yǎng)基中孵育，篩選并揀選抗體陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞。

四、抗體生產(chǎn)：
將揀選得到的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)展到較大規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)中，并進(jìn)行抗體生產(chǎn)。通常情況下，每隔3-4天換一次新的培養(yǎng)液，并逐漸增加抗體的濃度。待培養(yǎng)液中的抗體濃度達(dá)到一定水平后，可通過(guò)多種方法如親和層析、蛋白A/G柱層析等來(lái)純化抗體。

五、抗體檢測(cè)鑒定：
制備好的小鼠E-Tag抗體需要進(jìn)行鑒定，以確保其具有正確的免疫反應(yīng)性和特異性。常用的鑒定方法包括免疫印跡、免疫熒光檢測(cè)、ELISA等。其中免疫印跡是最常用的鑒定方法，通過(guò)與已知含E標(biāo)簽的蛋白在免疫印跡膜上進(jìn)行反應(yīng)，以判斷抗體的特異性和敏感性。

制備小鼠E-Tag抗體的主要步驟包括抗原制備、免疫小鼠、雜交瘤細(xì)胞制備、抗體生產(chǎn)和抗體鑒定等。這些步驟需要仔細(xì)操作，確?？贵w的質(zhì)量和特異性，從而為后續(xù)的免疫學(xué)研究提供可靠的實(shí)驗(yàn)手段。