超濾離心提取外泌體步驟

日期：2023-05-29 16:29:52

超濾離心法是一種常用的外泌體提取方法，通過使用不同的分子量切點(diǎn)濾膜，可以有效地分離和富集各種大小的外泌體，從而方便后續(xù)分析和應(yīng)用。

以下是超濾離心提取外泌體的詳細(xì)步驟：

1、采集培養(yǎng)基或血漿等含有外泌體的樣品，并進(jìn)行預(yù)處理。首先，利用一些基本的生物學(xué)技術(shù)和試劑，去除樣品中的細(xì)胞碎片、蛋白酶和核酸等干擾物質(zhì)。例如，可以進(jìn)行低速離心去除細(xì)胞碎片，加入蛋白酶抑制劑和核酸酶等去除蛋白質(zhì)和核酸污染等。

2、將預(yù)處理后的樣品進(jìn)行低速離心，以去除未破裂的細(xì)胞和碎片等。通常使用300 × g或500 × g等相對(duì)低速度離心10-20分鐘，收集上清液。

3、再將上清液進(jìn)行高速離心，目的是將外泌體等細(xì)胞外囊泡沉積下來。通常使用1500 × g或2000 × g等的相對(duì)高速度離心30-40分鐘，收集沉淀。注意，不同技術(shù)和實(shí)驗(yàn)條件下，高速離心的時(shí)間和速度可能有所不同。

4、將外泌體沉淀洗滌，以去除殘留的蛋白酶、核酸酶等污染物。一般使用緩沖鹽水或PBS等洗滌液，輕柔地重新懸浮沉淀，加入洗滌液后再進(jìn)行低速離心去除殘余污染物。

5、將洗滌后的外泌體樣品進(jìn)行超濾分離，以去除更大的碎片和細(xì)胞等雜質(zhì)，同時(shí)富集外泌體并控制其大小分布。對(duì)于超濾離心法，可以選擇不同的分子量切點(diǎn)濾膜，如100 kDa，50 kDa等，以分離不同尺寸的外泌體。將樣品置于篩選裝置中，如Amicon Ultra-15聚丙烯酰胺離心管，以適當(dāng)?shù)乃俣入x心。離心過程中，分子量小于切點(diǎn)的蛋白質(zhì)和外泌體會(huì)通過濾膜進(jìn)入下部收集室，分子量大于切點(diǎn)的物質(zhì)則被截留在膜上。通常使用1-2 mL的樣品進(jìn)行超濾，離心速度和時(shí)間取決于使用的濾膜型號(hào)和診斷儀器等。

6、將超濾液進(jìn)行洗滌和純化，以提高外泌體的純度和質(zhì)量?？梢圆捎貌煌姆椒ㄟM(jìn)行進(jìn)一步的純化操作，如封閉顆粒提取法、親和層析法等，根據(jù)具體情況進(jìn)行選擇。

超濾離心是一種強(qiáng)大的外泌體提取方法，能夠有效地富集外泌體并去除雜質(zhì)。按照上述步驟操作，可以獲得高純度的外泌體樣品，為后續(xù)的分子生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究提供了有力的基礎(chǔ)。