泛素化酵母雙雜交原理
日期：2023-06-29 17:03:48
泛素化酵母雙雜交（ubiquitin-based yeast two-hybrid，UB-TH）是用于檢測蛋白質(zhì)相互作用的實(shí)驗(yàn)方法。它基于酵母細(xì)胞中的蛋白質(zhì)泛素化機(jī)制和雙雜交原理。
泛素化是指將泛素分子共價地附著到其他蛋白質(zhì)上的過程。在UB-TH實(shí)驗(yàn)中，目標(biāo)是研究一個蛋白質(zhì)與另一個蛋白質(zhì)的相互作用。為了進(jìn)行這個實(shí)驗(yàn)，如下步驟被執(zhí)行：
構(gòu)建酵母表達(dá)載體：首先，目標(biāo)蛋白質(zhì)的編碼序列被克隆到一個表達(dá)泛素結(jié)構(gòu)域的載體中。該載體還包含可以激活或抑制基因轉(zhuǎn)錄的報(bào)告基因。
構(gòu)建酵母融合表達(dá)載體庫：其次，構(gòu)建一個酵母表達(dá)多肽庫，其中每個多肽都與一個蛋白質(zhì)編碼序列連接。這些多肽通常是來自一個復(fù)雜的生物樣品，如組織提取物或cDNA文庫。
HTDNA（High-throughput DNA）雙雜交篩選：然后，將目標(biāo)蛋白質(zhì)表達(dá)載體與融合表達(dá)載體庫一起轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞中。如果目標(biāo)蛋白質(zhì)與庫中的任何一個融合蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，目標(biāo)蛋白質(zhì)的泛素結(jié)構(gòu)域?qū)⒈环核鼗＿@導(dǎo)致目標(biāo)蛋白質(zhì)與報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄激活或抑制，從而產(chǎn)生可測量的熒光或生長。
驗(yàn)證相互作用：通過進(jìn)一步驗(yàn)證，確認(rèn)在雙雜交篩選中檢測到的相互作用是否真實(shí)有效。常見的驗(yàn)證方法包括重復(fù)酵母雙雜交、共沉淀實(shí)驗(yàn)等。
通過UB-TH原理，可以鑒定和分析蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而理解細(xì)胞中的信號傳遞和調(diào)節(jié)機(jī)制。它在功能基因組學(xué)和藥物研發(fā)等領(lǐng)域中得到了廣泛應(yīng)用。
