泛素化酵母雙雜交原理
日期：2023-07-14 16:59:20
泛素化酵母雙雜交（ubiquitin-based yeast two-hybrid）是一種用于研究蛋白質(zhì)相互作用的實(shí)驗(yàn)方法。其原理基于以下幾個關(guān)鍵步驟：
構(gòu)建表達(dá)載體：將目標(biāo)基因的編碼區(qū)域連接到一個包含泛素序列的表達(dá)載體上。這樣，在目標(biāo)基因翻譯產(chǎn)生的融合蛋白中，泛素序列會緊密連接在其N-末端。
融合蛋白表達(dá)：將構(gòu)建好的表達(dá)載體導(dǎo)入酵母細(xì)胞，并利用適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)劑刺激目標(biāo)基因的表達(dá)，從而使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生融合蛋白。
靶蛋白與泛素酶相互作用：泛素酶（E3酶）在細(xì)胞中負(fù)責(zé)泛素化作用，將泛素共價連接到目標(biāo)蛋白上。在泛素化酵母雙雜交中，使用的泛素酶通常是酵母細(xì)胞自身的E3酶。
活性酶域重組：當(dāng)目標(biāo)蛋白被泛素化后，在酵母細(xì)胞中的特定酶域（例如，埃爾氏酵母中的乙酰膽堿酯酶）可與泛素連接的蛋白發(fā)生特異性相互作用。
雙雜交檢測：通過對酵母細(xì)胞進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪x擇篩選，識別出與目標(biāo)蛋白相互作用的酶域。常用方法包括生長選擇實(shí)驗(yàn)和報告基因檢測等。
通過這種方法，我們可以鑒定目標(biāo)蛋白與其他蛋白之間的物理相互作用，并進(jìn)一步研究與其相關(guān)的信號通路、調(diào)控機(jī)制等生物學(xué)問題。
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