酵母雙雜交自激活驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)步驟
日期：2023-08-21 16:47:33
酵母雙雜交（Yeast Two-Hybrid）是常用的蛋白質(zhì)相互作用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。在進(jìn)行雙雜交自激活驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)時(shí)，可以按照以下步驟進(jìn)行操作：
實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：
準(zhǔn)備兩個(gè)酵母菌株：一個(gè)是用于檢測(cè)蛋白質(zhì)自激活的菌株（例如AH109），另一個(gè)是作為質(zhì)粒攜帶者和報(bào)告基因表達(dá)的菌株（例如Y187）。
構(gòu)建融合蛋白質(zhì)的載體：將待檢測(cè)蛋白的編碼序列克隆到適當(dāng)?shù)碾p雜交載體中，通常包括激活區(qū)域（AD）和DNA結(jié)合區(qū)域（BD）。
驗(yàn)證載體的無毒性：通過轉(zhuǎn)化含有空載體的菌株來驗(yàn)證載體本身不會(huì)導(dǎo)致菌株生長異常。
轉(zhuǎn)化酵母菌株：
將質(zhì)粒攜帶者（例如Y187）和融合蛋白質(zhì)的載體（例如AH109）分別線性化，然后通過化學(xué)方法或電擊法將線性化DNA轉(zhuǎn)化到相應(yīng)的酵母菌株中。
進(jìn)行選擇培養(yǎng)：將轉(zhuǎn)化后的酵母菌分別移植到含有選擇性培養(yǎng)基的平板上，以篩選出具有正確載體的菌落。
進(jìn)行交互檢測(cè)：
鑒定陽性相互作用：將篩選得到的陽性菌落分別提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增和序列分析，確認(rèn)融合蛋白質(zhì)的正確定序。
進(jìn)行雙雜交驗(yàn)證：將陽性菌株分別轉(zhuǎn)化到兩個(gè)不同的抗性選擇培養(yǎng)基中（例如TDO和QDO培養(yǎng)基），觀察是否出現(xiàn)報(bào)告基因（如 HIS3、Ade2和LacZ）表達(dá)的現(xiàn)象。
設(shè)置對(duì)照組：設(shè)置空載體對(duì)照和已知相互作用的陽性對(duì)照，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
結(jié)果分析：
觀察菌落生長情況：在選擇培養(yǎng)基上觀察菌落生長，陽性菌株應(yīng)在TDO和QDO培養(yǎng)基上能夠生長。
檢測(cè)報(bào)告基因表達(dá)：使用相應(yīng)的檢測(cè)方法（如X-gal染色、HIS3和Ade2的活性檢測(cè)）來測(cè)試報(bào)告基因的表達(dá)水平，以確認(rèn)蛋白質(zhì)的相互作用。
以上步驟僅概述了雙雜交自激活驗(yàn)證的基本流程，具體的實(shí)驗(yàn)操作和條件可能因?qū)嶒?yàn)?zāi)康暮驮噭┖械炔煌兴町悺Ｔ谶M(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，請(qǐng)仔細(xì)閱讀相關(guān)文獻(xiàn)和試劑盒的說明，并按照其中提供的操作指南進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
