靶點(diǎn)蛋白敲除方法

日期：2023-05-31 13:57:46

靶點(diǎn)蛋白敲除是基因組編輯技術(shù)中應(yīng)用最為廣泛的一種。傳統(tǒng)的方法是使用外源DNA片段替換目標(biāo)基因的編碼區(qū)域，這種方法被稱(chēng)為基因敲除。隨著基因組編輯技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在還出現(xiàn)了一些更加高效和精準(zhǔn)的方法，例如CRISPR/Cas9系統(tǒng)、TALEN、ZFN等。

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一、傳統(tǒng)的基因敲除方法

1、全部敲除法

這種方法是將目標(biāo)基因的全部編碼區(qū)域替換為外源DNA片段。首先，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到目標(biāo)基因的上下游序列，并將其克隆入質(zhì)粒載體中，構(gòu)建成敲除載體。然后，將該載體導(dǎo)入目標(biāo)細(xì)胞中，使其進(jìn)行重組，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的敲除。使用這種方法可以完全清除目標(biāo)基因，但往往需要較長(zhǎng)的外源DNA片段，很難實(shí)現(xiàn)精確敲除，因此不太適合進(jìn)行基因組宏大的研究。

2、部分敲除法

這種方法是在目標(biāo)基因上引入一個(gè)位點(diǎn)突變，以使該基因不能正常運(yùn)作。在這種情況下，由于敲除的部位僅限于編碼區(qū)域的一部分，因此需要較短的外源DNA片段，更加容易實(shí)現(xiàn)精確敲除。常用的方法是利用CRISPR/Cas9技術(shù)或者TALEN技術(shù)進(jìn)行基因敲除。

二、基因組編輯技術(shù)

1、CRISPR/Cas9系統(tǒng)

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是一種高效的基因組編輯技術(shù)，它可以通過(guò)簡(jiǎn)單的設(shè)計(jì)和構(gòu)建sgRNA來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的敲除。其中，sgRNA的作用是與Cas9蛋白結(jié)合，在目標(biāo)位點(diǎn)上形成一個(gè)雙鏈斷裂，從而引發(fā)細(xì)胞的修復(fù)機(jī)制，最終導(dǎo)致目標(biāo)基因的敲除。與其他方法相比，CRISPR/Cas9技術(shù)具有效率高、精確度高、快速、便捷等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為基因組編輯領(lǐng)域最為常用的工具之一。

2、TALEN技術(shù)

TALEN技術(shù)是另一種基因組編輯技術(shù)，也可以用于實(shí)現(xiàn)基因敲除。它利用特異性核酸酶切割目標(biāo)基因的DNA序列，從而導(dǎo)致目標(biāo)基因的敲除。與其他方法相比，TALEN技術(shù)具有更高的準(zhǔn)確性和更低的假陽(yáng)性率，但是需要設(shè)計(jì)和合成更加復(fù)雜的分子，相對(duì)而言還需要更多的時(shí)間和資源。

3、ZFN技術(shù)

ZFN技術(shù)是一種基于人工合成的鋅指蛋白的核酸結(jié)合能力來(lái)定向切割目標(biāo)基因的DNA序列，并從而實(shí)現(xiàn)基因敲除的技術(shù)。類(lèi)似于TALEN技術(shù)，ZFN也需要設(shè)計(jì)和合成較為復(fù)雜的分子，并需要進(jìn)行構(gòu)建和驗(yàn)證，因此較為耗時(shí)和費(fèi)力。

三、總結(jié)

靶點(diǎn)蛋白敲除是一種常用的分子生物學(xué)技術(shù)，在基因組編輯技術(shù)的發(fā)展過(guò)程中，不斷有新的技術(shù)涌現(xiàn)，以提高敲除效率和精度。傳統(tǒng)的基因敲除方法包括全部敲除法和部分敲除法，但由于其精確性、效率等方面的局限性，已經(jīng)逐漸被CRISPR/Cas9系統(tǒng)、TALEN和ZFN等技術(shù)所取代。這些新技術(shù)具有更高的效率和更低的假陽(yáng)性率，對(duì)于基因敲除和其他基因組編輯技術(shù)的研究提供了更強(qiáng)大的工具和手段。