膜蛋白酵母雙雜交技術(shù)原理和步驟
日期：2023-06-02 11:37:11
膜蛋白酵母雙雜交技術(shù)是一種常用的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，用于研究蛋白質(zhì)相互作用。該技術(shù)利用酵母細(xì)胞膜蛋白作為分子載體，將兩個目標(biāo)蛋白質(zhì)分別與酵母細(xì)胞膜蛋白的兩個域連接在一起，通過檢測酵母細(xì)胞的生長或轉(zhuǎn)錄激活來判斷目標(biāo)蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。以下是膜蛋白酵母雙雜交技術(shù)的原理和步驟：
一、原理
膜蛋白酵母雙雜交技術(shù)利用酵母細(xì)胞膜蛋白的兩個域——DNA結(jié)合域和激活域來構(gòu)建分子載體。其中DNA結(jié)合域可與DNA序列結(jié)合，并具有轉(zhuǎn)錄激活功能的激活域可激活下游基因的轉(zhuǎn)錄。通過將兩個要檢測的蛋白質(zhì)分別融合到這兩個域上，形成酵母細(xì)胞膜蛋白與目標(biāo)蛋白質(zhì)的融合蛋白，若融合蛋白能形成復(fù)合物，則激活下游基因的轉(zhuǎn)錄，酵母細(xì)胞生長，反之則不生長。這樣就可以通過檢測酵母細(xì)胞的生長情況來判斷目標(biāo)蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。
二、步驟
1、構(gòu)建膜蛋白酵母雙雜交載體
膜蛋白酵母雙雜交載體通常包括兩個部分：酵母表面膜蛋白的DNA結(jié)合域（BD）和激活域（AD）。點(diǎn)突變或保留的氨基酸序列將目標(biāo)蛋白質(zhì)或其片段接入到BD或AD中。
2、轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞
將構(gòu)建好的BD和AD載體分別轉(zhuǎn)化入兩個酵母菌株中，在培養(yǎng)基中篩選出具有BD和AD融合的酵母細(xì)胞菌落。
3、半定量或定量檢測生長
將BD和AD融合的兩種酵母細(xì)胞混合在含有不同濃度的抗性劑和缺失選擇性基因的培養(yǎng)基上。如果兩種酵母細(xì)胞中的融合蛋白質(zhì)可以相互作用，則會激活下游的選擇性基因，使酵母細(xì)胞生長，并且一定時間后成為明顯的菌落。然而，如果兩種酵母細(xì)胞中的融合蛋白不能相互作用，則不會生長菌落。
半定量檢測方法：將要檢測的酵母細(xì)胞分別稀釋后點(diǎn)在含有不同濃度的抗性劑和缺失選擇性基因的培養(yǎng)基上, 一般以濃度級差為1:5,1:10或1:100。培養(yǎng)2~4天后觀察生長情況即可。
定量檢測方法：將自感和雜交酵母細(xì)胞的混合物均勻涂布于含有不同抗性劑濃度的平板上后，計(jì)算細(xì)胞增殖的程度，從而確定相互作用強(qiáng)度的差異。
4、確認(rèn)相互作用
通過對生長的酵母細(xì)胞進(jìn)行重復(fù)自由浸潤篩選，進(jìn)一步檢驗(yàn)融合蛋白量的特異性、真實(shí)性和重復(fù)性?？梢允褂闷渌麑?shí)驗(yàn)來進(jìn)一步證實(shí)相互作用，如質(zhì)譜法、共免疫沉淀法等。
通過膜蛋白酵母雙雜交技術(shù)，可以快速檢測目標(biāo)蛋白質(zhì)之間的相互作用，并且具有靈敏度高、可重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)已成功應(yīng)用于細(xì)胞信號傳導(dǎo)和蛋白質(zhì)在生命活動中的作用研究。
