重組蛋白表達(dá)與純化實(shí)驗(yàn)原理
日期：2023-07-27 14:15:08
重組蛋白表達(dá)與純化是一種常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，用于在大量細(xì)胞中表達(dá)目標(biāo)蛋白，并從混合物中純化出目標(biāo)蛋白。其主要原理如下：
基因克?。菏紫?，將目標(biāo)蛋白的基因插入到合適的表達(dá)載體中。這可以通過PCR擴(kuò)增或化學(xué)合成得到目標(biāo)基因，并使用限制性內(nèi)切酶將其插入到表達(dá)載體的適當(dāng)位置。
轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化：將重組表達(dá)載體導(dǎo)入到細(xì)胞中，使其轉(zhuǎn)染（對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞）或轉(zhuǎn)化（對(duì)于大腸桿菌等細(xì)菌）。這可以通過化學(xué)方法、電穿孔、病毒介導(dǎo)等多種方式實(shí)現(xiàn)。
蛋白表達(dá)和細(xì)胞培養(yǎng)：經(jīng)過轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化后，細(xì)胞開始轉(zhuǎn)錄和翻譯目標(biāo)基因，合成目標(biāo)蛋白。在培養(yǎng)條件（如適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基、溫度、氣體等）下，細(xì)胞會(huì)大量表達(dá)目標(biāo)蛋白。
細(xì)胞破碎：培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)過一定時(shí)間后，需要將其破碎以釋放蛋白質(zhì)。這可以通過超聲波破碎、高壓破碎、化學(xué)方法等實(shí)現(xiàn)，將細(xì)胞內(nèi)的目標(biāo)蛋白釋放到溶液中。
蛋白純化：通過一系列的分離和純化步驟，從細(xì)胞裂解液中純化出目標(biāo)蛋白。常用的純化方法包括親和層析、離子交換層析、凝膠過濾層析、透析、超濾等。這些方法根據(jù)目標(biāo)蛋白的特性（如大小、電荷、親和性等）選擇合適的純化步驟。
蛋白質(zhì)純化后的質(zhì)量檢測(cè)：純化后的目標(biāo)蛋白需要進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)以確認(rèn)其純度和功能。常用的檢測(cè)方法包括SDS-PAGE凝膠電泳、Western blot、質(zhì)譜分析等。
重組蛋白表達(dá)與純化技術(shù)使得科研人員能夠大量獲得目標(biāo)蛋白，并進(jìn)一步進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)解析、功能研究、藥物篩選等實(shí)驗(yàn)。這對(duì)于基礎(chǔ)生物學(xué)研究、藥物開發(fā)和生物工程等領(lǐng)域具有重要意義。
