重組蛋白在原核表達系統(tǒng)中常出現(xiàn)包涵體表達，如何解決這一問題？
日期：2025-04-02 13:22:00
在原核表達系統(tǒng)中，重組蛋白出現(xiàn)包涵體表達的原因主要是蛋白折疊不正確、表達量過高以及細胞內(nèi)環(huán)境不適宜等。以下是一些解決包涵體問題的方法：
1.優(yōu)化表達條件
降低誘導溫度：較低的溫度可以減緩蛋白合成速度，使蛋白有更多時間進行正確折疊。一般可將誘導溫度從 37℃降至 16 - 25℃，具體溫度需通過實驗優(yōu)化。例如，在表達某些膜蛋白時，將溫度控制在 20℃左右，可顯著減少包涵體的形成。
減少誘導劑濃度：降低誘導劑（如 IPTG）的濃度，能降低重組蛋白的表達速度，有助于蛋白正確折疊?？梢試L試將 IPTG 濃度從常規(guī)的 1 mM 降低至 0.1 - 0.5 mM。
縮短誘導時間：適當縮短誘導時間，避免蛋白過度表達而形成包涵體。誘導時間可從常規(guī)的 4 - 6 小時調(diào)整為 2 - 4 小時，然后根據(jù)表達情況進行優(yōu)化。
2.優(yōu)化載體設計
更換啟動子：選擇較弱的啟動子，使重組蛋白的表達水平適中，減少因表達量過高導致的包涵體形成。例如，將強啟動子 T7 替換為相對較弱的 trc 或 lac 啟動子。
添加融合標簽：在目標蛋白的 N 端或 C 端添加融合標簽，如谷胱甘肽 S - 轉(zhuǎn)移酶（GST）、麥芽糖結合蛋白（MBP）等。這些標簽可以幫助蛋白正確折疊，增加蛋白的可溶性，同時也有利于后續(xù)的純化。
3.優(yōu)化宿主菌選擇
選擇蛋白酶缺陷型菌株：某些宿主菌缺失了一些蛋白酶，能夠減少對重組蛋白的降解，使蛋白更易以可溶形式表達。如 BL21（DE3）pLysS 菌株，其含有溶菌酶基因，可降低細胞內(nèi)的蛋白酶活性。
選用分子伴侶輔助表達菌株：一些菌株如 Rosetta - gami B（DE3）pLysS 含有額外的分子伴侶和折疊酶，能幫助重組蛋白正確折疊，提高其可溶性。
4.改善培養(yǎng)條件
優(yōu)化培養(yǎng)基成分：調(diào)整培養(yǎng)基中的碳源、氮源、微量元素等成分，以滿足重組蛋白表達和折疊的需求。例如，增加培養(yǎng)基中甘氨酸、脯氨酸等有助于蛋白折疊的氨基酸含量。
控制 pH 值：維持合適的 pH 值有助于蛋白的正確折疊。一般來說，中性或略偏堿性的環(huán)境（pH 7.0 - 7.5）有利于大多數(shù)蛋白的表達和溶解。
5.包涵體的處理與復性
包涵體的溶解：如果包涵體已經(jīng)形成，可以采用變性劑如尿素、鹽酸胍等將其溶解，使蛋白變?yōu)榫€性結構。然后通過透析、稀釋等方法去除變性劑，使蛋白在體外重新折疊。
復性條件優(yōu)化：復性過程中，需要優(yōu)化復性緩沖液的成分、溫度、pH 值等條件。例如，在復性緩沖液中加入氧化 - 還原試劑如谷胱甘肽，有助于蛋白二硫鍵的正確形成。同時，緩慢降低變性劑濃度，避免蛋白重新聚集。
