如何進(jìn)行重組蛋白的定量？
日期：2025-04-30 15:19:00
常用的方法有 Bradford 法，利用蛋白與考馬斯亮藍(lán)染料結(jié)合后顏色變化來(lái)定量，操作簡(jiǎn)便、快速，但對(duì)不同蛋白的顯色反應(yīng)可能有差異；BCA 法，基于二價(jià)銅離子在堿性條件下被蛋白還原為一價(jià)銅離子，一價(jià)銅離子與 BCA 試劑形成紫色復(fù)合物進(jìn)行定量，準(zhǔn)確性較高，受干擾因素較少；還有紫外分光光度法，根據(jù)蛋白在 280nm 處的吸光值來(lái)定量，但該方法易受核酸等物質(zhì)的干擾，需要進(jìn)行校正。
重組蛋白的定量方法有多種，以下是一些常見(jiàn)的方法：
紫外分光光度法
原理：蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、色氨酸等氨基酸殘基在 280nm 波長(zhǎng)處有特征性吸收峰，在一定濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的吸光度與蛋白質(zhì)濃度成正比，因此可通過(guò)測(cè)定蛋白質(zhì)溶液在 280nm 處的吸光度來(lái)計(jì)算其濃度。
操作：將待測(cè)的重組蛋白溶液適當(dāng)稀釋后，放入石英比色皿中，以緩沖液作為空白對(duì)照，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其在 280nm 處的吸光度值，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線或經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算出蛋白濃度。
特點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、快速，不消耗樣品，可用于初步定量。但該方法的準(zhǔn)確性易受蛋白質(zhì)氨基酸組成、溶液中其他吸光物質(zhì)的干擾，對(duì)于含有核酸等雜質(zhì)的蛋白樣品，需要采用校正公式進(jìn)行計(jì)算。
Bradford 法
原理：考馬斯亮藍(lán) G - 250 在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，其最大吸收峰從 465nm 移至 595nm，且在一定濃度范圍內(nèi)，溶液在 595nm 處的吸光度與蛋白質(zhì)濃度成正比，通過(guò)與已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液進(jìn)行比較，可測(cè)定出未知樣品的蛋白濃度。
操作：首先制備一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，然后分別加入適量的 Bradford 試劑，混合均勻后室溫放置一段時(shí)間，以空白對(duì)照為參比，用分光光度計(jì)測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)品在 595nm 處的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)待測(cè)的重組蛋白樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋，加入 Bradford 試劑后，按照同樣的方法測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白濃度。
特點(diǎn)：靈敏度高，能檢測(cè)到微克級(jí)的蛋白質(zhì)，且反應(yīng)迅速，顏色穩(wěn)定。但不同蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)的結(jié)合能力存在差異，可能導(dǎo)致結(jié)果有一定偏差，同時(shí)干擾物質(zhì)較多，如去污劑、還原劑等會(huì)影響測(cè)定結(jié)果。
Lowry 法
原理：蛋白質(zhì)中的肽鍵在堿性條件下與銅離子形成絡(luò)合物，該絡(luò)合物能使酚試劑中的磷鉬酸 - 磷鎢酸還原，生成藍(lán)色化合物，在一定濃度范圍內(nèi)，藍(lán)色的深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，通過(guò)比色法可測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。
操作：將標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液和待測(cè)蛋白樣品分別與堿性銅試劑混合，室溫放置后再加入酚試劑，充分反應(yīng)后在一定時(shí)間內(nèi)用分光光度計(jì)測(cè)定其在 750nm 或 650nm 處的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算樣品蛋白濃度。
特點(diǎn)：靈敏度較高，比紫外分光光度法靈敏 10 - 20 倍。但操作步驟較多，反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，且受多種物質(zhì)干擾，如糖類、脂類等。
BCA 法
原理：在堿性條件下，蛋白質(zhì)將二價(jià)銅離子還原為一價(jià)銅離子，一價(jià)銅離子與 BCA 試劑形成紫色復(fù)合物，在 562nm 處有最大吸收峰，其吸光度與蛋白質(zhì)濃度成正比，以此來(lái)定量蛋白質(zhì)。
操作：配置不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，加入 BCA 工作液后，在 37℃或室溫下孵育一段時(shí)間，然后用分光光度計(jì)測(cè)定 562nm 處的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將待測(cè)重組蛋白樣品稀釋后，按照同樣的步驟進(jìn)行操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度。
特點(diǎn)：靈敏度高，對(duì)不同蛋白質(zhì)的檢測(cè)差異較小，受干擾物質(zhì)影響相對(duì)較小，且操作簡(jiǎn)單，適合大量樣品的快速檢測(cè)。不過(guò)，與 Lowry 法類似，該方法也需要較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間。
高效液相色譜法（HPLC）
原理：根據(jù)蛋白質(zhì)的大小、電荷、疏水性等特性，通過(guò)不同類型的色譜柱將重組蛋白與其他雜質(zhì)分離，然后利用紫外檢測(cè)器或熒光檢測(cè)器等對(duì)蛋白進(jìn)行定量分析。例如，使用尺寸排阻色譜柱時(shí)，蛋白質(zhì)按照分子大小進(jìn)行分離，大分子先洗脫出來(lái)，小分子后洗脫出來(lái)，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)蛋白的保留時(shí)間和峰面積進(jìn)行對(duì)比，可計(jì)算出樣品中重組蛋白的含量。
操作：首先將蛋白樣品進(jìn)行適當(dāng)處理，如過(guò)濾、稀釋等，然后注入到 HPLC 系統(tǒng)中，選擇合適的色譜柱和流動(dòng)相條件進(jìn)行分離和檢測(cè)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白的色譜圖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)樣品中重組蛋白的峰面積或峰高，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算出其濃度。
特點(diǎn)：具有高分辨率、高靈敏度和準(zhǔn)確性的優(yōu)點(diǎn)，能同時(shí)對(duì)多種蛋白質(zhì)進(jìn)行分離和定量，適用于復(fù)雜樣品中重組蛋白的精確測(cè)定。但儀器設(shè)備昂貴，操作相對(duì)復(fù)雜，需要專業(yè)人員進(jìn)行維護(hù)和操作。
