在上一期中，我們簡(jiǎn)單介紹了去垢劑的基本性質(zhì)及其在膜蛋白中的應(yīng)用。在含有去垢劑的緩沖中，大部分膜蛋白可以維持穩(wěn)定性和活性。但少數(shù)對(duì)去垢劑敏感的膜蛋白是不適宜含有去垢劑的緩沖條件的，具體表現(xiàn)為無(wú)法純化（例如純化出的膜蛋白十分雜且得率非常低），穩(wěn)定性不好（易于降解或有明顯沉淀）和沒(méi)有活性（可能該膜蛋白對(duì)去垢劑敏感，或其活性需要磷脂雙分子層的結(jié)構(gòu)）。針對(duì)這類膜蛋白，我們建議嘗試nanodiscs技術(shù)。目前，Nanodiscs技術(shù)在膜蛋白的分離、純化、結(jié)構(gòu)研究和功能表征方面展現(xiàn)了重要的優(yōu)勢(shì)。本文介紹nanodiscs的成分和結(jié)構(gòu)，nanodiscs與liposomes的對(duì)比以及nanodiscs在膜蛋白中的應(yīng)用。希望通過(guò)我們的介紹，可以幫助您進(jìn)一步了解膜蛋白。

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1.Nanodiscs的成分和結(jié)構(gòu)

Nanodiscs的主要成分是合成磷脂和兩親性螺旋蛋白（amphipathic helical protein），也叫做膜支架蛋白（membrane scaffold protein，MSP）。膜支架蛋白與血清載脂蛋白相關(guān)，而血清載脂蛋白是高密度脂蛋白的主要成分。2個(gè)膜支架蛋白為帶狀，環(huán)繞著磷脂，如下圖Fig 1^[1]，即盤狀磷脂雙分子層Nanodiscs。

2. 模型膜

我們主要對(duì)比liposomes和nanodiscs兩種模型膜。

2.1 Liposomes

Liposomes是兩親性脂雙層的囊泡。制備liposomes有許多方法，其中最有名最不要求設(shè)備的方法是Bangham法^[2]。將目的脂質(zhì)溶解于揮發(fā)性有機(jī)溶劑中，在惰性氣流下干燥。用水溶性緩沖渦旋所得的薄層脂質(zhì)，然后通過(guò)各種方法，例如超聲、均質(zhì)化和用尺寸已知的過(guò)濾器擠出（一般為100-200nm孔徑尺寸），最后轉(zhuǎn)化為單層囊泡。這也導(dǎo)致了liposomes非常明顯的劣勢(shì)，不穩(wěn)定、不均質(zhì)、難以復(fù)制等。

Liposomes易于聚集和融合，通常在長(zhǎng)時(shí)間或在某些物理操作下是不穩(wěn)定的，例如停止流動(dòng)或劇烈混合。通過(guò)擠出機(jī)制備的liposomes尺寸并不是均質(zhì)的，不同批次制備可能存在明顯差異^[3]。組裝入liposomes中的膜蛋白通常會(huì)導(dǎo)致樣品渾濁和粘稠，這可能會(huì)限制一些生物化學(xué)分析技術(shù)的應(yīng)用。

2.2 Nanodiscs

制備nanodiscs首先要準(zhǔn)備包含磷脂、膜支架蛋白和去垢劑的混合物，一旦除去去垢劑，剩余的成分即組裝為直徑為8-16nm的盤狀磷脂雙分子層，即nanodiscs^[4]。Nanodiscs的直徑由MSP帶的長(zhǎng)度決定，當(dāng)磷脂與MSP處于最佳摩爾比時(shí)，即形成均勻的nanodiscs。

對(duì)比liposomes，Nanodiscs的尺寸分布更加均質(zhì)（在一次制備中）和一致（在不同批次的制備中）；nanodiscs有更加精準(zhǔn)的顆粒尺寸大小，可以通過(guò)調(diào)節(jié)MSP的序列長(zhǎng)度來(lái)調(diào)節(jié)大?。?span lang="EN-US">nanodiscs更加穩(wěn)定。

3.Nanodiscs在膜蛋白中的應(yīng)用

關(guān)于Nanodiscs的應(yīng)用，已經(jīng)有非常優(yōu)秀的綜述^[5]，關(guān)于結(jié)構(gòu)的研究可具體見(jiàn)下表，可應(yīng)用于結(jié)構(gòu)生物學(xué)，適用于電子顯微鏡、NMR、EPR和光譜檢測(cè)技術(shù)等各種技術(shù)。

Table 1. Methods and tools used with MPs incorporated into nanodiscs

4.利用大腸無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)和nanodiscs技術(shù)表達(dá)AQPs

Cusabio結(jié)合大腸無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)和nanodiscs技術(shù)，在大腸無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)體系中加入預(yù)組裝的nanodiscs。膜蛋白邊翻譯邊組裝入nanodiscs里，形成膜蛋白-nanodiscs復(fù)合物（Fig 2.）。這種模擬的人造脂質(zhì)環(huán)境為分析不同的脂質(zhì)對(duì)膜蛋白的影響提供了新的途經(jīng)，讓我們更好的理解膜蛋白。下圖Fig 3.為 Escherichia coli Aquaporin Z(aqpZ)成功組裝入nanodiscs后，SDS-PAGE的檢測(cè)結(jié)果。由圖可見(jiàn)有2條帶，一條為MSP，一條為目的膜蛋白aqpZ。

下圖Fig 3.為 Escherichia coli Aquaporin Z(aqpZ)成功組裝入nanodiscs后，SDS-PAGE的檢測(cè)結(jié)果。由圖可見(jiàn)有2條帶，一條為MSP，一條為目的膜蛋白aqpZ。

Fig 2. Schematic illustration of a MSP nanodiscs with a 7-transmembrane protein embedded.Diameter is about 10.6 nm. Picture from Sligar.

Fig 3.

Cusabio表達(dá)膜蛋白新方案

     提供無(wú)風(fēng)險(xiǎn)膜蛋白表達(dá)服務(wù)（去垢劑方案）和300aa以下的無(wú)風(fēng)險(xiǎn)組裝入nanodics服務(wù)。歡迎咨詢！

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往期回顧：

Detergent的性質(zhì)及其在膜蛋白中的應(yīng)用

Refenrences

[1] Applications of Phospholipid Bilayer Nanodiscs in the Study of Membranes and Membrane Proteins. Abhinav Nath, William M. Atkins, and Stephen G. Sligar. Biochemistry, 2007, 46 (8), 2059-2069

[2] Large volume liposomes by an ether vaporization method. D Deamer, AD Bangham. Biochimica et Biophysica Acta, 443 (1976) 629-~34

[3] Applications of Phospholipid Bilayer Nanodiscs in the Study of Membranes and Membrane Proteins. Abhinav Nath, William M. Atkins, and Stephen G. Sligar. Biochemistry, 2007, 46 (8), 2059-2069

[4] Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins. Timothy H. Bayburt,Yelena V. Grinkova, and Stephen G. Sligar. Nano Letters, 2002, 2 (8), pp 853–856

[5]Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins.Ilia G Denisov & Stephen G Sligar.Nature Structural & Molecular Biology 23, 481–486 (2016)