見(jiàn)微知著——外泌體再掀生命科學(xué)熱潮

利劍出鞘——華美高效率提取“納米膠囊”
 

美國(guó)抗衰老醫(yī)學(xué)研究會(huì)主席 Ronald Klatz 博士（抗衰老臨床醫(yī)學(xué)的先驅(qū)和主要權(quán)威人士之一）曾表示：「外泌體是干細(xì)胞技術(shù)的下一個(gè)發(fā)展方向」。

外泌體于1983年首次在體外培養(yǎng)的綿羊紅細(xì)胞上清液中發(fā)現(xiàn)且能被多種細(xì)胞分泌，當(dāng)時(shí)外泌體的發(fā)現(xiàn)并沒(méi)有引起太多關(guān)注，被認(rèn)為僅僅是成熟的紅細(xì)胞的廢物。

2013年，外泌體因諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)而被眾人知曉，也因此將外泌體研究推向了新高潮。外泌體在體液中廣泛存在及易獲得性等特點(diǎn)被譽(yù)為液體活檢"新秀"，成為疾病的精確診斷和治療研究的熱點(diǎn)。

外泌體是什么

外泌體（Exosomes）是一種能被機(jī)體內(nèi)大多數(shù)細(xì)胞分泌的直徑大約為30-150 nm 的具有脂質(zhì)雙層膜的微小膜泡，它廣泛存在并分布于血清、血漿、唾液、尿液、腦脊液和乳液等多種體液中。

 

外泌體攜帶和傳遞重要的信號(hào)分子，包含細(xì)胞溶質(zhì)蛋白、參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白、各種代謝酶、熱休克蛋白和四跨膜蛋白及特殊蛋白質(zhì)，參與細(xì)胞活動(dòng)的重要調(diào)控，形成了一種全新的細(xì)胞間信息傳遞系統(tǒng)。其影響細(xì)胞的生理狀態(tài)并與多種疾病的發(fā)生與進(jìn)程密切相關(guān)，有望成為多種疾病的早期診斷標(biāo)志物。

 

外泌體的表面marker主要有CD9、CD63、CD81、PKM、ENO1、TSG101、熱休克蛋白家族等。其中脂質(zhì)雙分子層中含有豐富的Phosphatidylserine。

 

▲圖片來(lái)源：Exosomes:Fundamental Biology and Roles in Cardiovascular Physiology

 

外泌體研究熱潮不減

通過(guò)長(zhǎng)久以來(lái)不斷進(jìn)化，大自然創(chuàng)造并優(yōu)化了這些“納米膠囊”，用于在人體各組織間傳遞分子。如今，外泌體在生物技術(shù)方面的潛力受到了重視。

 

外泌體研究已經(jīng)成為近年來(lái)SCI期刊和基金資助的雙熱點(diǎn)。

 

近年來(lái)外泌體相關(guān)研究駛?cè)肟燔嚨溃叻治恼赂穷l頻發(fā)表。據(jù)統(tǒng)計(jì)，Pubmed收錄的外泌體研究相關(guān)文章數(shù)量呈逐年遞增態(tài)勢(shì)。2020年文章量高達(dá)4277篇，較2019年增長(zhǎng)近32%。而2021年上半年文章量已累計(jì)近3000篇，一路高歌猛進(jìn)，呈現(xiàn)暴風(fēng)增長(zhǎng)。

(來(lái)源：Pubmed)
 

而美國(guó)資助基金的外泌體研究項(xiàng)目迅速增加，目前已資助"外泌體"課題達(dá)5563項(xiàng)。其中正在資助的470項(xiàng)課題中，外泌體研究涉及神經(jīng)系統(tǒng)、細(xì)胞外基質(zhì)、mRNA、干細(xì)胞、T細(xì)胞、癌癥、免疫、病毒感染、心血管疾病及HIV感染、囊性纖維化、敗血癥等廣泛領(lǐng)域。

 

制藥巨頭扎堆 瞄準(zhǔn)外泌體黃金賽場(chǎng)

在資本的助力下，外泌體在治療和診斷方向的應(yīng)用也從實(shí)驗(yàn)室的研究階段迅速推進(jìn)，迎來(lái)了產(chǎn)業(yè)化合作新浪潮，成為下一個(gè)群雄角逐的黃金賽場(chǎng)。外泌體產(chǎn)業(yè)在歐美日已蓬勃發(fā)展，迄今為止，全球約有40多家外泌體治療和診斷的公司。

2020年6月份，禮來(lái)、武田、拜耳宣布了與外泌體公司高達(dá)20億美元的交易。其中，禮來(lái)與英國(guó)Evox Therapeutics 簽署了一項(xiàng)價(jià)值 12 億美元的合作協(xié)議，未來(lái)雙方將利用Evox專有的外泌體藥物遞送平臺(tái)，開(kāi)發(fā)RNA干擾和反義寡核苷酸藥物有效遞送載體，用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療。

今年2月18日，位于英國(guó)的Evox Therapeutics從OrbiMed和谷歌風(fēng)投籌集了6920萬(wàn)英鎊（約9540萬(wàn)美元），以推進(jìn)其外泌體療法進(jìn)入臨床試驗(yàn)，專注于可用裝載蛋白質(zhì)或RNA的外泌體治療的罕見(jiàn)疾病。

 

全球許多生物技術(shù)公司競(jìng)相開(kāi)發(fā)外泌體，例如Exosomics、Carmine Therapeutics、Vesigen Therapeutics、Mantra Bio和Aruna Bio等。近年來(lái)，很多國(guó)際制藥巨頭也紛紛投入這個(gè)領(lǐng)域來(lái)，羅氏（Roche）、武田、禮來(lái)已經(jīng)分別與擁有這一創(chuàng)新技術(shù)平臺(tái)的公司達(dá)成多項(xiàng)高額合作，開(kāi)發(fā)外泌體靶向療法。在投資者日益增加的資金支持的刺激下，該領(lǐng)域或?qū)⒃谖磥?lái)幾年掀起一波熱潮。希望隨著研究的開(kāi)展和技術(shù)的進(jìn)步，外泌體作為藥物載體的研究可以取得快速的進(jìn)展和新的突破。

 

外泌體市場(chǎng)/臨床應(yīng)用

作為液體活檢領(lǐng)域的"三大標(biāo)桿"之一，外泌體被認(rèn)為是細(xì)胞間通訊、疾病診斷和預(yù)后循環(huán)生物標(biāo)志物的重要載體，外泌體通過(guò)其攜帶的脂質(zhì)、核酸、蛋白質(zhì)、miRNA等來(lái)調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的生物學(xué)活性，從而參與機(jī)體免疫應(yīng)答、細(xì)胞遷移、腫瘤侵襲、抗原提呈等生物學(xué)過(guò)程。大量的證據(jù)表明外泌體及其內(nèi)容物具有成為新型診斷標(biāo)志物的潛能，在臨床和治療方面展現(xiàn)出了極具前景的研究?jī)r(jià)值。

外泌體在腫瘤中的應(yīng)用前景非常廣闊。在液體活檢層面，外泌體相對(duì)易于獲取，攜帶足夠的生物信息，因此能夠攜帶腫瘤早期標(biāo)志物信息，提供早期診斷的機(jī)會(huì)。對(duì)于中晚期患者而言，外泌體能夠用于治療標(biāo)志物預(yù)測(cè)，幫助臨床選擇治療方案，同時(shí)在治療過(guò)程中提供動(dòng)態(tài)監(jiān)控，幫助更好地獲益。

外泌體與細(xì)胞膜融合可將所攜帶的物質(zhì)和信號(hào)傳遞到受體細(xì)胞并改變其生物學(xué)功能，因此，外泌體是納米藥物遞送或基因治療的潛在載體。也可以將外泌體作為藥物遞送的媒介，為其構(gòu)建靶向性，使其用于遞送治療劑，從而擴(kuò)展現(xiàn)有精準(zhǔn)治療的給藥方式。

前期研究發(fā)現(xiàn)，外泌體可自發(fā)富集于肝臟，因此，載藥外泌體在治療肝臟相關(guān)疾病如原位肝癌、肝衰竭、肝纖維化和脂肪肝等疾病方面具有巨大的應(yīng)用前景。自然分泌的外泌體分離純化直接作為藥物的潛力有限，但是，將自然的外泌體分泌所需組分摻入合成脂質(zhì)體或納米顆粒中，并且使用可控程序組裝后的工程化外泌體模擬物在藥學(xué)上擁有更大的應(yīng)用潛力。

 

外泌體分離提取

研究外泌體內(nèi)涵成分的前提是對(duì)其進(jìn)行高質(zhì)量的提取，由于外泌體粒徑較小且與多種其他生物分子混合在一起，導(dǎo)致其分離純化困難，阻礙了對(duì)其的進(jìn)一步研究。

近年來(lái)，研究人員根據(jù)外泌體理化性質(zhì)研發(fā)了多種分離純化方法：常用的有超速離心法、密度梯度超速離心法、超濾法、多聚物沉淀法（PEG）、免疫磁珠法、試劑盒分離法等。

而對(duì)于外泌體的分離，首先要關(guān)注外泌體的提取質(zhì)量，包括純度、囊泡狀態(tài)、得率及重復(fù)性等方面的評(píng)估，然后才是技術(shù)路線的選擇。

 

 

⊙超速離心法是最常用的外泌體純化手段，目前已發(fā)表文獻(xiàn)引用最多的方法，采用低速離心、高速離心交替進(jìn)行，可分離到大小相近的囊泡顆粒。

優(yōu)點(diǎn)：無(wú)需特殊試劑，操作簡(jiǎn)便，適合大批量樣本。

缺點(diǎn)：耗時(shí)耗力，純度相對(duì)較低，回收率不穩(wěn)定，重復(fù)離心會(huì)一定程度損傷外泌體，設(shè)備要求高。

⊙密度梯度超速離心法是在超速離心力作用下，使蔗糖溶液形成從低到高連續(xù)分布的密度階層，是一種區(qū)帶分離法。通過(guò)密度梯度離心，樣品中的外泌體將在1.13-1.19g/mL的密度范圍富集。

優(yōu)點(diǎn)：純度相對(duì)較高，適合大批量樣本。

缺點(diǎn)：步驟繁瑣，耗時(shí)，回收率不穩(wěn)定，重復(fù)離心會(huì)一定程度損傷外泌體，設(shè)備要求高。

⊙超濾法是將溶劑及小分子物質(zhì)過(guò)濾到膜的另一側(cè)，而將相對(duì)大分子物質(zhì)截留在超濾膜上，以達(dá)到分離的目的。

優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單高效，不影響外泌體的完整性。

缺點(diǎn)：外泌體可能會(huì)阻塞過(guò)濾孔，導(dǎo)致膜的壽命減短，分離效率和純度較低。此外，截留在膜上的外泌體間也會(huì)發(fā)生粘附，導(dǎo)致產(chǎn)量降低。

⊙多聚物沉淀法根據(jù)化合物與外泌體的理化特性，利用共沉淀或者反向篩選的方式對(duì)外泌體進(jìn)行分離純化。

優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、無(wú)設(shè)備限制。

缺點(diǎn)：純度較低，存在假陽(yáng)性（雜蛋白較多或一些難以去除的聚合物），機(jī)械力或化學(xué)添加物對(duì)外泌體產(chǎn)生破壞，存在于分離物中的聚合物也可能會(huì)干擾下游分析等。

⊙抗體親和（磁珠）法利用包被單克隆抗體的磁珠結(jié)合外泌體，外泌體表面有其特異性標(biāo)記物（如CD63、CD9蛋白），用包被抗標(biāo)記物抗體的磁珠與外泌體囊泡孵育后結(jié)合，即可將外泌體吸附并分離出來(lái)。

優(yōu)點(diǎn)：純度較高，特異性和重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便、無(wú)設(shè)備限制。

缺點(diǎn)：效率和回收率較低，僅能捕獲表達(dá)特定抗原的目標(biāo)外泌體，外泌體生物活性易受pH和鹽濃度影響，囊泡完整性影響較大。

 

綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)的方法提取到的外泌體，缺陷在于：收率較低，耗時(shí)長(zhǎng)、純度不高，外泌體囊泡不完整等。

 

鑒于上述問(wèn)題，武漢華美生物工程有限公司研發(fā)的外泌體提取試劑盒提供了一種簡(jiǎn)單可靠的方法可從細(xì)胞培養(yǎng)上清液，血清，血漿，乳液，尿液，唾液，酵母，植物中提取完整的外泌體。該產(chǎn)品提取的外泌體囊泡適用于下游的電鏡分析、NTA分析、納米流式（NanoFCM）分析、Western Blot、熒光定量（qPCR）和高通量測(cè)序等應(yīng)用。

該試劑盒通過(guò)蛋白親和的方式分離外泌體，無(wú)需超速離心即可實(shí)現(xiàn)高效率地從各種類型樣本中提取高純度、囊泡結(jié)構(gòu)完整的外泌體，具有簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、易操作的優(yōu)點(diǎn)：

• 適用于各種樣品類型(細(xì)胞培養(yǎng)上清液，血清，血漿，乳液，尿液，唾液、酵母、植物)

• 適用于各種細(xì)胞上清液中外泌體的分離提取(A375，HEPG2，PC-3，Hela，U87，MG63等)

• 所提取的外泌體囊泡結(jié)構(gòu)完整，呈球形或碟形，顆粒均勻

• 高產(chǎn)量，單次提取，可獲得3*1011 個(gè)/mL 外泌體囊泡

• 操作簡(jiǎn)單無(wú)設(shè)備要求（不需要超速離心）

 

 

武漢華美生物工程有限公司(www.pptc.cn)成立于2007年12月，是一家集科研、生產(chǎn)、銷售為一體的生物高新技術(shù)企業(yè)。并形成了以CUSABIO為品牌的ELISA試劑盒、蛋白、抗體等多種優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品，遠(yuǎn)銷歐美日德等九十多個(gè)國(guó)家。

2018年3月31日，華美生物兄弟公司生之源與2013年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)得主蘭迪·謝克曼教授舉行簽約儀式，并建立諾貝爾獎(jiǎng)工作站。此舉大大助推了華美外泌體相關(guān)科研產(chǎn)品的研究和生產(chǎn)！

華美生物研發(fā)的外泌體(Exosome)提取試劑盒廣泛兼容各種樣本類型和各種細(xì)胞上清液(如A375，HEPG2，PC-3，Hela，U87，MG63等)，為廣大生物醫(yī)學(xué)科研學(xué)者提供高質(zhì)量的產(chǎn)品與技術(shù)服務(wù)。

 

外泌體研究吸引著生命科學(xué)各個(gè)領(lǐng)域的科學(xué)家。華美CUSABIO提供外泌體提取試劑盒，將助力研究人員探秘其功能，擴(kuò)大其醫(yī)學(xué)應(yīng)用。
 

☆外泌體相關(guān)標(biāo)志物精品抗體：

GAPDH Monoclonal Antibody (CSB-MA000071M0m)

CD9 Monoclonal Antibody (CSB-MA004969A0m)

CD63 Monoclonal Antibody (CSB-MA004950A0m)

ENO1 Monoclonal Antibody (CSB-MA007670A0m)

PKM Monoclonal Antibody (CSB-MA018072A0m)

 

 

外泌體未來(lái)展望

外泌體爆炸性研究活動(dòng)已經(jīng)慢慢演變?yōu)榉肿俞t(yī)學(xué)的快速發(fā)展。外泌體在臨床醫(yī)學(xué)中有十分光明的應(yīng)用前景，主要是因?yàn)樗鼈兒胸S富的生物標(biāo)志物，可用于監(jiān)測(cè)臨床狀態(tài)、診斷疾病、治療反應(yīng)、疾病進(jìn)展等。重要且有影響力外泌體研究領(lǐng)域會(huì)隨著高效率的外泌體分離技術(shù)的發(fā)展而發(fā)展。

外泌體可作為生物標(biāo)志物用于疾病的診斷，也推動(dòng)了以外泌體為靶標(biāo)的治療方法研究或?qū)⑼饷隗w本身用作治療工具的研究。將外泌體用作治療工具的臨床研究正在開(kāi)展之中，其目的是研究患者自身MSC分泌外泌體或健康捐贈(zèng)者體內(nèi)外泌體用于治療的安全性和有效性。這個(gè)趨勢(shì)下，外泌體用作藥物輸送系統(tǒng)作為基因治療的潛在載體有可能變得更加普遍。外泌體在癌癥中同時(shí)發(fā)揮免疫激活和免疫抑制功能，外泌體腫瘤免疫療法有望誕生抗癌疫苗。

外泌體作為疾病診斷標(biāo)志物的潛在應(yīng)用依賴于基于外泌體的藥物遞送系統(tǒng)的技術(shù)突破，理論上能夠從外泌體中檢測(cè)到DNA序列變異、RNA的表達(dá)變化、蛋白質(zhì)變化等。要將其用于臨床治療，外泌體的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)還面臨很大的挑戰(zhàn)。首先，對(duì)外泌體的具體合成機(jī)制、功能了解并不是非常詳細(xì)。其次，存在外泌體分離技術(shù)、分離量、及檢測(cè)技術(shù)的挑戰(zhàn)，外泌體在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用還需要加強(qiáng)和深入研究。然而，雖然當(dāng)前外泌體生物學(xué)仍然不成熟，但越來(lái)越多的興趣和資金投入必將加速外泌體基礎(chǔ)研究進(jìn)展和臨床轉(zhuǎn)化。

 

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——華美生物·讓科研變得有溫度！——