1. 特異性的選擇

特異性的選擇主要需要考慮四個方面：蛋白質(zhì)的特異性、物種的特異性、實驗方法的特異性以及標記的特異性。

1.1 蛋白質(zhì)的特異性

什么是蛋白質(zhì)的特異性？一般來說，蛋白質(zhì)的特異性指的是蛋白質(zhì)結(jié)合位點與特定配體結(jié)合的能力。一個蛋白質(zhì)-配體的例子就是抗體-抗原系統(tǒng)，它們之間的結(jié)合活性可以被描述為高度特異。了解了蛋白質(zhì)的特異性后，理解抗體的特異性將更加容易。每個單個抗體蛋白都能夠通過其Y形狀抗體蛋白的可變區(qū)頂端的獨特抗原結(jié)合位點，與抗原上的一個唯一表位特異結(jié)合。這種特異性能夠精確檢測目標抗原。

常數(shù)區(qū)域在一個給定類型的所有抗體中都是相同的，選擇抗體時根據(jù)檢測的蛋白質(zhì)，需要了解以下細節(jié)：

a. 如果重組蛋白并不完整表達，需要確認抗原結(jié)合位點是否位于重組蛋白的序列范圍內(nèi)。

b. 對于內(nèi)源性蛋白質(zhì)，最好了解它們的剪接和修飾情況。對于具有特殊表型的蛋白質(zhì)，需要通過比較免疫原序列和感興趣的蛋白質(zhì)序列進行序列比對，以檢查物種的交叉反應(yīng)性。

c. 檢測磷酸化蛋白質(zhì)需要確定特定的磷酸化位點。不同的磷酸化位點意味著可能存在不同的機制，不能一概而論。

1.2 物種特異性

同源蛋白在不同物種之間存在更多或更少的變異。

a. 大多數(shù)商業(yè)抗體是使用源自人類蛋白質(zhì)序列的重組蛋白或肽段制備的，因此它們可能基于序列同源性與其他物種發(fā)生交叉反應(yīng)。您需要查看抗體數(shù)據(jù)表中標明的物種反應(yīng)性。

b. 對于一些稀有物種，很難找到適用的抗體。在這種情況下，您應(yīng)該通過序列比對選擇使用同源序列產(chǎn)生的抗體，但通常制造商不會接受關(guān)于質(zhì)量的投訴。如果您能從供應(yīng)商處獲得免費的抗體樣品，將更容易選擇到合適的抗體。

1.3 實驗方法的特異性

許多實驗需要使用抗體。在不同的方法中，由于樣品制備和目標蛋白含量的差異，對于表位和抗體效價有不同的要求。

1.4 標記的特異性

常見的實驗，如WB和IHC，通常不需要標記的一抗，而是使用標記的二抗。然而，某些基于儀器分析的實驗可能會使用標記的一抗，例如流式細胞術(shù)（FC）。在這種情況下，需要了解所使用儀器可以檢測的熒光光譜，并根據(jù)不同的參數(shù)要求選擇合適的標記。在免疫熒光雙標記實驗中，應(yīng)選擇和匹配不同的熒光標記。

2. 抗體的選擇取決于實驗/應(yīng)用

2.1 如何選擇WB抗體?

許多人建議使用單克隆抗體作為WB的一抗。目前，多克隆抗體生產(chǎn)技術(shù)與單克隆抗體生產(chǎn)技術(shù)一樣成熟。因此，許多多克隆抗體在WB中也表現(xiàn)良好。除了一抗和二抗外，WB還涉及到負載控制抗體的使用，這有助于確認整個凝膠中的蛋白質(zhì)負載是相同的。加載控制通常是在你所研究的細胞類型中高水平表達的蛋白質(zhì)。最后但并非最不重要的是，無論你做什么實驗，建議參考相關(guān)文獻來選擇合適的抗體。

2.2 如何選擇適用于IP/ChIP的抗體？

在免疫共沉淀（IP）中，抗體與目標蛋白的自然形式結(jié)合。因此，適用于IP的最佳抗體是使用純化的自然蛋白或純化的重組蛋白制備的抗體。最好不要使用使用合成肽制備的抗體，因為這種抗體識別的區(qū)域可能深藏在目標蛋白的內(nèi)部。

免疫沉淀（ChIP）與IP之間沒有太大區(qū)別。唯一的問題是，如果抗體識別的目標蛋白區(qū)域與結(jié)合到DNA的目標蛋白區(qū)域相同，實驗可能會失敗。

2.3 如何選擇適用于IF/IHC的抗體？

在免疫熒光（IF）/免疫組化（IHC）中，有一個重要的步驟叫做固定，用于保留細胞和亞細胞結(jié)構(gòu)。固定會使蛋白質(zhì)變性和固定，意味著這些蛋白質(zhì)與其自然形式不同，但也不同于在免疫印跡（WB）中看到的線性結(jié)構(gòu)。因此，對于IF/IHC，首選的抗體是使用純化的重組蛋白或使用蛋白質(zhì)表面的合成肽制備的抗體。

2.4 如何選擇適用于FC的抗體？

流式細胞術(shù)（FC）可以分為活細胞FC和固定細胞FC兩種類型。對于活細胞FC，最好選擇使用自然蛋白或重組蛋白制備的抗體；對于固定細胞FC，使用的抗體與IF/IHC中使用的抗體相同。在FC中，有直接標記和間接標記兩種方法。間接標記相對于直接標記來說準確性較低。因此，在進行FC時，最好選擇帶有熒光標記的抗體；如果沒有針對目標蛋白的標記抗體，則可以選擇間接標記，其中需要使用帶有熒光染料的二抗。

3. 主抗體和二抗的選擇

3.1 如何選擇一抗？

a. 確認抗體的名稱。全名、縮寫、替代名稱、亞型等細節(jié)都需要考慮。

b. 確認實驗/應(yīng)用的類型。ELISA、WB、IHC、ICC、FACS或其他？一般來說，抗體的產(chǎn)品說明書會列出該抗體在哪些應(yīng)用中經(jīng)過驗證。如果抗體的產(chǎn)品說明書沒有提及特定的應(yīng)用，這并不意味著該抗體不適用于該應(yīng)用，只是表示該抗體在該應(yīng)用中沒有經(jīng)過驗證。但一般而言，最好根據(jù)產(chǎn)品說明書中列出的驗證信息選擇合適的抗體。

c. 確認樣本的物種。人類、小鼠、大鼠、綿羊、魚類還是山羊？一般來說，抗體的產(chǎn)品說明書會包含物種反應(yīng)性的信息。有了這些信息，你可以確定該抗體是否適用于你的實驗。

d. 目標蛋白的結(jié)構(gòu)特性。了解目標蛋白的結(jié)構(gòu)特性將有助于你選擇合適的抗體。這些結(jié)構(gòu)信息包括目標蛋白的結(jié)構(gòu)域、樣本制備過程中蛋白質(zhì)是否變性、蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化以及可能影響免疫親和反應(yīng)的其他因素。

e. 單克隆抗體和多克隆抗體的選擇。市場上以多克隆抗體為主導(dǎo)。與多克隆抗體相比，單克隆抗體具有更高的特異性但親和力較低，從而導(dǎo)致相對較低的抗原檢測靈敏度。多克隆抗體具有較低的特異性但較高的親和力，因此其靈敏度更高。使用多克隆抗體可能會增加非特異性染色的風險，可以通過阻斷或其他步驟來避免這種情況。

3.2 如何選擇二抗?

a. 種類或來源。根據(jù)一抗的種類選擇二抗。例如，如果在小鼠體內(nèi)培養(yǎng)一抗，二抗就會對小鼠抗體產(chǎn)生反應(yīng)。

b. 標簽的選擇。有不同的標簽，如HRP，生物素和熒光素。SP三步法一般采用生物素標記的二抗與SP反應(yīng)，熒光素染色采用羅丹明、FITC、Cy3等不同熒光素標記的二抗體。

4. 常見問題解答

當您購買抗體時，抗體供應(yīng)商/制造商通常會提供額外的技術(shù)支持，這非常重要。在過去，購買了我們公司Cusabio的抗體的一些客戶尋求了技術(shù)支持。以下是一些最常見的問題。

4.1 FC抗體與IHC抗體相同嗎?

它們不一定是相同的抗體。對于FC，有直接標記和間接標記。對于直接標記，抗體通常是FITC, TRITC或pe標記。如果你碰巧做免疫組化并且想要使用熒光素標記的抗體直接標記，那么你可以使用相同的抗體。如果你想在免疫組化中使用其他標記或間接標記，可能會遇到麻煩，因為熒光素標記可能會影響二抗與一抗的結(jié)合。

4.2 為什么我的抗體在WB中表現(xiàn)很好，但在其他實驗如IF和IHC中卻不起作用?

首先，恭喜你有一個良好的抗體。畢竟，要獲得好的抗體并不容易。其次，你的抗體可能是用合成肽產(chǎn)生的。如上所述，你的抗體識別的抗原肽可能恰好隱藏在目標蛋白的中心，所以你的抗體只能識別WB中的線性蛋白。

4.3 如何選擇用于免疫組織化學（IHC）的抗體？

首先，需要決定選擇單克隆抗體還是多克隆抗體。單克隆抗體和多克隆抗體的區(qū)別已經(jīng)在前面總結(jié)過。如果您的實驗需要高特異性，單克隆抗體可能是更好的選擇。如果陽性信號較弱，可以嘗試多克隆抗體。多克隆抗體通常是從兔子中獲得的，而單克隆抗體通常是從小鼠中獲得的。當然，還有其他動物提供的抗體。

其次，了解主抗體可以與哪些物種反應(yīng)很重要。這些信息通常在抗體產(chǎn)品說明書中說明。

第三，您應(yīng)該注意主抗體的來源。例如，當您在人類癌組織中進行IHC檢測p53，并使用小鼠產(chǎn)生的抗-p53抗體作為主抗體時，您必須選擇抗小鼠的二抗，如山羊抗小鼠抗體和兔抗小鼠抗體?？傊?，主抗體和二抗應(yīng)匹配。

最后，抗體產(chǎn)品說明書通常包含抗體適用的應(yīng)用程序信息。如果說明書指出該抗體不能用于IHC，不要選擇它。即使說明書強調(diào)該抗體可用于IHC，也有一些情況下該抗體在IHC中效果不佳。自行驗證抗體可以幫助您獲得成功的實驗結(jié)果。

4.4 WB次級抗體和IF次級抗體相同嗎？

顯然不相同！IF次級抗體用于免疫熒光試驗，并且標記有FITC、PE或其他能夠被紫外光激活的標記物，信號通過熒光顯微鏡檢測。WB次級抗體通常標記有HRP、堿性磷酸酶或其他能與顯色底物（如OPD\TMB）反應(yīng)的分子，結(jié)果可以直接用肉眼觀察或通過化學發(fā)光儀器檢測。

4.5 ChIP抗體能在WB中使用嗎？

不一定。一般來說，ChIP抗體對純度、特異性和其他參數(shù)有更高的要求。因此，ChIP抗體通?？梢栽赪B中使用。然而，ChIP抗體識別的是構(gòu)象性抗原表位，而不是線性表位。這種類型的ChIP抗體不能在WB中使用。

4.6 如果抗體產(chǎn)品說明書中沒有提及特定的應(yīng)用程序怎么辦？

通常，抗體會在WB、IP、IF和IHC中進行驗證。因此，最好不要將抗體用于未在抗體產(chǎn)品說明書中提及的實驗。

4.7 ELISA抗體可以用于WB嗎？

對于WB，抗體的稀釋倍數(shù)通常為1:1000；對于IF/IHC，為1:100；對于ELISA，為1:10000。如果一個抗體用于ELISA，通常意味著抗體效價不高。這并不意味著所有用于ELISA的抗體都不能用于WB。如果抗體產(chǎn)品說明書上說明ELISA的稀釋倍數(shù)為1:1000，那么可以嘗試1:100的稀釋倍數(shù)進行WB實驗。