如何表達(dá)具有生物活性的蛋白質(zhì)？
日期：2024-01-26 10:25:19
蛋白質(zhì)生產(chǎn)--生產(chǎn)特定蛋白質(zhì)的過程--已成為生物和生物醫(yī)學(xué)科學(xué)中一項(xiàng)極其重要的生物技術(shù)。在大多數(shù)情況下，相關(guān)蛋白質(zhì)在體內(nèi)具有某種形式的生物活性。根據(jù)所生產(chǎn)蛋白質(zhì)的用途，我們可能會(huì)對(duì)其生物活性提出不同的要求。但如何才能確保生產(chǎn)的蛋白質(zhì)具有生物活性呢？本文將重點(diǎn)討論這個(gè)問題，并提供一些解決方案。
首先，需要選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)。
經(jīng)過多年的發(fā)展，已經(jīng)出現(xiàn)了多種表達(dá)系統(tǒng)，通?？煞譃榧?xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)?；诩?xì)胞的系統(tǒng)可分為細(xì)菌系統(tǒng)（包括大腸桿菌、棒狀桿菌和熒光假單胞菌）和真核系統(tǒng)（包括酵母（Saccharomyces cerevisiae、Pichia Pastoris）、絲狀真菌、桿狀病毒感染細(xì)胞、非溶解性昆蟲細(xì)胞表達(dá)、利什曼菌和哺乳動(dòng)物系統(tǒng)）。從這么多不同的表達(dá)系統(tǒng)中選擇一種合適的系統(tǒng)有些困難，因?yàn)椴煌谋磉_(dá)系統(tǒng)可能有不同的特點(diǎn)。例如，大腸桿菌是一種原核生物，缺乏糖基化修飾等翻譯后修飾機(jī)制，因此通常不適合表達(dá)復(fù)雜的真核蛋白質(zhì)。
請(qǐng)?jiān)L問此處閱讀表格，進(jìn)一步了解五種常用表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用。它將幫助您選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)。
其次，需要選擇合適的載體。
載體是一種 DNA 分子，可幫助將外來遺傳物質(zhì)輸送到另一個(gè)細(xì)胞中，并在其中復(fù)制和/或表達(dá)?？寺≥d體是一種有用的方法，可以產(chǎn)生許多感興趣基因的拷貝。表達(dá)載體會(huì)影響基因在目標(biāo)生物體內(nèi)轉(zhuǎn)化為 mRNA 和蛋白質(zhì)的實(shí)際表達(dá)。在質(zhì)粒、病毒載體、cosmids 和人工染色體這四種主要載體中，質(zhì)粒最常用。有一系列可用的質(zhì)粒載體，但如何選擇最佳載體呢？影響載體選擇的因素有很多，如插入大小、拷貝數(shù)、不相容性、可選擇標(biāo)記、克隆位點(diǎn)和專門的載體功能等。以下是常用載體表。
表1 華美生物常用載體
在選擇矢量時(shí)，您最好考慮這些因素：
① 插入片段的大小
這里唯一需要考慮的是你要克隆的是大DNA片段還是小DNA片段。為了操作方便，載體必須是相對(duì)較小的分子。過大的載體可能會(huì)影響復(fù)制并導(dǎo)致穩(wěn)定性問題。通常，質(zhì)粒可以處理長(zhǎng)達(dá) 15 kb 的插入片段。但也有一些特殊的質(zhì)?？梢蕴幚砀蟮牟迦胛?。
② 可選擇標(biāo)記
需要選擇性標(biāo)記。標(biāo)記可用于識(shí)別陽性轉(zhuǎn)化子?？蛇x擇標(biāo)記主要有兩類：抗藥性標(biāo)記（包含一種能使特定抗生素失活的酶的編碼基因）和輔助營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記（能使帶有標(biāo)記的細(xì)胞在沒有培養(yǎng)基中必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的情況下存活）。
③ 限制位點(diǎn)
必須有多個(gè)方便的限制性位點(diǎn)，用于插入要克隆的 DNA。
④ 拷貝數(shù)
一般來說，高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體更好。但在某些情況下，需要低拷貝載體，因?yàn)楦呖截愘|(zhì)?？赡軙?huì)導(dǎo)致毒性等問題。
第三，需要選擇適當(dāng)?shù)募兓椒ā?br />
對(duì)于某些應(yīng)用，粗提取物就足夠了。但對(duì)于其他用途，則需要高純度。要生產(chǎn)出高純度的蛋白質(zhì)，就必須對(duì)所生產(chǎn)的蛋白質(zhì)進(jìn)行純化。蛋白質(zhì)純化是指從細(xì)胞、組織或整個(gè)生物體中分離出一種或多種蛋白質(zhì)的過程。目前已開發(fā)出多種純化策略，如尺寸排阻色譜法（SEC）、基于電荷或疏水性的分離法、親和色譜法（AC）和高效液相色譜法（HPLC）。
第四，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)很重要。
要確認(rèn)所生產(chǎn)蛋白質(zhì)的生物活性，通常需要進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。應(yīng)測(cè)量折疊、修飾和活性。重組蛋白的生物活性通常是通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等生物檢測(cè)方法來測(cè)定的。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和西部印跡法（WB）是檢測(cè)復(fù)雜混合物中特定蛋白質(zhì)的兩種最有效的方法。
ELISA 是一種利用抗體和顏色變化來識(shí)別具有抗原特性的物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、激素、細(xì)菌抗原和抗體）的方法。ELISA 檢測(cè)通常具有高度靈敏性和特異性。
WB 是一種根據(jù)蛋白質(zhì)與特定抗體結(jié)合的能力來識(shí)別和定位蛋白質(zhì)的技術(shù)。它可以提供有關(guān)蛋白質(zhì)大小的信息（與以 kDa 為單位的大小標(biāo)記或梯子進(jìn)行比較），還可以提供有關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)的信息（與對(duì)照組進(jìn)行比較，如未經(jīng)處理的樣本或其他細(xì)胞類型或組織）。
總之，表達(dá)具有生物活性的重組蛋白是一個(gè)復(fù)雜的過程，需要考慮很多方面。作為生產(chǎn)商，Cusabio 可提供蛋白質(zhì)表達(dá)服務(wù)，幫助您開展研究。有關(guān)華美生物蛋白服務(wù)的更多詳情，請(qǐng)?jiān)L問 http://www.pptc.cn/protein_service/。
首先，需要選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)。
經(jīng)過多年的發(fā)展，已經(jīng)出現(xiàn)了多種表達(dá)系統(tǒng)，通?？煞譃榧?xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)?；诩?xì)胞的系統(tǒng)可分為細(xì)菌系統(tǒng)（包括大腸桿菌、棒狀桿菌和熒光假單胞菌）和真核系統(tǒng)（包括酵母（Saccharomyces cerevisiae、Pichia Pastoris）、絲狀真菌、桿狀病毒感染細(xì)胞、非溶解性昆蟲細(xì)胞表達(dá)、利什曼菌和哺乳動(dòng)物系統(tǒng)）。從這么多不同的表達(dá)系統(tǒng)中選擇一種合適的系統(tǒng)有些困難，因?yàn)椴煌谋磉_(dá)系統(tǒng)可能有不同的特點(diǎn)。例如，大腸桿菌是一種原核生物，缺乏糖基化修飾等翻譯后修飾機(jī)制，因此通常不適合表達(dá)復(fù)雜的真核蛋白質(zhì)。
請(qǐng)?jiān)L問此處閱讀表格，進(jìn)一步了解五種常用表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用。它將幫助您選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)。
其次，需要選擇合適的載體。
載體是一種 DNA 分子，可幫助將外來遺傳物質(zhì)輸送到另一個(gè)細(xì)胞中，并在其中復(fù)制和/或表達(dá)?？寺≥d體是一種有用的方法，可以產(chǎn)生許多感興趣基因的拷貝。表達(dá)載體會(huì)影響基因在目標(biāo)生物體內(nèi)轉(zhuǎn)化為 mRNA 和蛋白質(zhì)的實(shí)際表達(dá)。在質(zhì)粒、病毒載體、cosmids 和人工染色體這四種主要載體中，質(zhì)粒最常用。有一系列可用的質(zhì)粒載體，但如何選擇最佳載體呢？影響載體選擇的因素有很多，如插入大小、拷貝數(shù)、不相容性、可選擇標(biāo)記、克隆位點(diǎn)和專門的載體功能等。以下是常用載體表。
表1 華美生物常用載體
| 表達(dá)系統(tǒng) | 載體 | 標(biāo)簽 |
| 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng) | pGEX-6p-1 | N-terminal GST-tagged |
| pGEX-4T-1 | N-terminal GST-tagged | |
| pGEX-4T-2 | N-terminal GST-tagged | |
| pET21a(+) | C-terminal 6xHis-tagged | |
| pET21b(+) | C-terminal 6xHis-tagged | |
| pET22b(+) | C-terminal 6xHis-tagged | |
| pET-23b(+) | C-terminal 6xHis-tagged | |
| pET-26b(+) | C-terminal 6xHis-tagged | |
| pET28a(+) | N-terminal 6xHis-tagged and C-terminal 6xHis-tagged | |
| pET-29a(+) | C-terminal 6xHis-tagged | |
| pET30a(+) | N-terminal 6xHis-tagged and C-terminal 6xHis-tagged | |
| pET32a(+) | N-terminal 6xHis-Trx-tagged and C-terminal 6xHis-tagged | |
| pET-43.1a(+) | N-terminal 6xHis-NusA-tagged and C-terminal 6xHis-tagged | |
| pMal-c2X | N-terminal MBP-tagged | |
| pColdIII | NO-tagged | |
| pBV220 | NO-tagged | |
| pACYCDuet-1 | N-terminal 6xHis-tagged | |
| pETDuet-1 | N-terminal 6xHis-tagged | |
| 酵母表達(dá)系統(tǒng) | pPIC9K | NO-tagged |
| pPIC3.5K | NO-tagged | |
| pPICZα A | C-terminal Myc-tagged and C-terminal 6xHis-tagged | |
| pGAPZα A | C-terminal Myc-tagged and C-terminal 6xHis-tagged | |
| pPICZ A | C-terminal Myc-tagged and C-terminal 6xHis-tagged | |
| pPinkα-HC | NO-tagged | |
| pPinkα-LC | NO-tagged | |
| 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) | pCMV6-Entry | C-terminal Flag-tagged |
| pSecTag2A | C-terminal 6xHis-tagged | |
| pTT5 | NO-tagged | |
| 昆蟲-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng) | pFastBac 1 | NO-tagged |
| pFastBac HTB | N-terminal 6xHis-tagged | |
| pFastBac Dual | NO-tagged | |
| 無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) | pET21a | N-10xHis tag |
| pET28a-sumo | N-10xHis tag-sumo tag | |
| pET23b | C-6xHis tag |
在選擇矢量時(shí)，您最好考慮這些因素：
① 插入片段的大小
這里唯一需要考慮的是你要克隆的是大DNA片段還是小DNA片段。為了操作方便，載體必須是相對(duì)較小的分子。過大的載體可能會(huì)影響復(fù)制并導(dǎo)致穩(wěn)定性問題。通常，質(zhì)粒可以處理長(zhǎng)達(dá) 15 kb 的插入片段。但也有一些特殊的質(zhì)?？梢蕴幚砀蟮牟迦胛?。
② 可選擇標(biāo)記
需要選擇性標(biāo)記。標(biāo)記可用于識(shí)別陽性轉(zhuǎn)化子?？蛇x擇標(biāo)記主要有兩類：抗藥性標(biāo)記（包含一種能使特定抗生素失活的酶的編碼基因）和輔助營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記（能使帶有標(biāo)記的細(xì)胞在沒有培養(yǎng)基中必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的情況下存活）。
③ 限制位點(diǎn)
必須有多個(gè)方便的限制性位點(diǎn)，用于插入要克隆的 DNA。
④ 拷貝數(shù)
一般來說，高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體更好。但在某些情況下，需要低拷貝載體，因?yàn)楦呖截愘|(zhì)?？赡軙?huì)導(dǎo)致毒性等問題。
第三，需要選擇適當(dāng)?shù)募兓椒ā?br />
對(duì)于某些應(yīng)用，粗提取物就足夠了。但對(duì)于其他用途，則需要高純度。要生產(chǎn)出高純度的蛋白質(zhì)，就必須對(duì)所生產(chǎn)的蛋白質(zhì)進(jìn)行純化。蛋白質(zhì)純化是指從細(xì)胞、組織或整個(gè)生物體中分離出一種或多種蛋白質(zhì)的過程。目前已開發(fā)出多種純化策略，如尺寸排阻色譜法（SEC）、基于電荷或疏水性的分離法、親和色譜法（AC）和高效液相色譜法（HPLC）。
第四，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)很重要。
要確認(rèn)所生產(chǎn)蛋白質(zhì)的生物活性，通常需要進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。應(yīng)測(cè)量折疊、修飾和活性。重組蛋白的生物活性通常是通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等生物檢測(cè)方法來測(cè)定的。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和西部印跡法（WB）是檢測(cè)復(fù)雜混合物中特定蛋白質(zhì)的兩種最有效的方法。
ELISA 是一種利用抗體和顏色變化來識(shí)別具有抗原特性的物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、激素、細(xì)菌抗原和抗體）的方法。ELISA 檢測(cè)通常具有高度靈敏性和特異性。
WB 是一種根據(jù)蛋白質(zhì)與特定抗體結(jié)合的能力來識(shí)別和定位蛋白質(zhì)的技術(shù)。它可以提供有關(guān)蛋白質(zhì)大小的信息（與以 kDa 為單位的大小標(biāo)記或梯子進(jìn)行比較），還可以提供有關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)的信息（與對(duì)照組進(jìn)行比較，如未經(jīng)處理的樣本或其他細(xì)胞類型或組織）。
總之，表達(dá)具有生物活性的重組蛋白是一個(gè)復(fù)雜的過程，需要考慮很多方面。作為生產(chǎn)商，Cusabio 可提供蛋白質(zhì)表達(dá)服務(wù)，幫助您開展研究。有關(guān)華美生物蛋白服務(wù)的更多詳情，請(qǐng)?jiān)L問 http://www.pptc.cn/protein_service/。
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