定點突變是序列-功能研究中不可或缺的工具。然而，傳統(tǒng)的方法能力有限。華盛頓大學的研究人員開發(fā)出一種新方法，能夠以大規(guī)模并行的方式開展單個氨基酸的定點突變。這項成果于1月5日發(fā)表在《Nature Methods》雜志上。

目前的定點突變方法能力有限，每次只能靶定幾個堿基，且操作繁瑣，成本高昂。為了克服這些限制，華盛頓大學Jay Shendure領導的團隊開發(fā)出一種名為PALS（programmed allelic series）的方法，將基于芯片的DNA合成與重疊延伸突變相結合，以大規(guī)模并行的方式在每個cDNA模板引入單個突變。

首先，研究人員在芯片上合成突變引物，每條引物的中心附近有一個突變。這些引物的兩側帶有接頭，這樣可利用PCR去除。隨后將引物與野生型的正義鏈退火并延伸，并降解底物，擴增突變體。在接頭被剪掉后，大引物沿著野生型目的基因的反義鏈延伸。隨后降解底物，產(chǎn)生全長的單突變拷貝，并通過PCR擴增。

為了獲得全長序列，Shedure及其同事克隆突變的文庫，在每個克隆上添加一個隨機條形碼，并開展分層標簽指導的測序，獲得一組一致單體型及相關標簽。

作為概念證明，研究人員以酵母轉錄因子Gal4的DNA結合結構域（DBD）為模板，構建PALS文庫。他們針對結構域中的每個密碼子，將其替換成編碼其他氨基酸的密碼子或提前終止密碼子。研究人員發(fā)現(xiàn)，~47%的全長單體型有且只有一個編程的突變。在這些“干凈”的克隆中，99.9%的單密碼子替換至少觀察到一次，而99.7%至少觀察到五次。

研究人員隨后轉到p53，看看他們的方法是否能擴展到靶定全長cDNA。與Gal4實驗不同，他們這一次通過簡并密碼子來替換p53的密碼子。結果，他們報告了較低的單突變單體型（33%），研究人員認為這可能是由于較長模板的二次錯誤概率增加。不過，研究人員仍然在干凈的單突變克隆中觀察到93.4%的氨基酸替換。

Shendure及其同事指出，總的來說，PALS的突變覆蓋度基本上是均一的，不過略為偏向N端，這在Gal4和p53研究中都觀察到。

研究人員還利用PALS開展了Gal4的深度突變掃描。他們將Gal4 DBD文庫引入雙雜交的報告系統(tǒng)。其中，Gal4基因被去除，替換為HIS3基因，它處于GAL1啟動子的控制之下。如果Gal4 DBD突變體能夠與DNA結合并激活轉錄，那么HIS3表達，則系統(tǒng)能夠在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基中生長。他們發(fā)現(xiàn)，在選擇但不是許可的條件下，提前終止密碼子是有害的，大約三分之一的殘基無法忍受突變。

Shendure及其同事表示：“PALS突變、功能選擇和深度測序的組合為解析人類基因的等位基因異質性提供了一個通用框架，也有助于對越來越多的意義不明的變異進行功能注釋。”