CRISPR/Cas9已經(jīng)成為一種通用的基因組工程工具，依賴于一個(gè)單導(dǎo)向RNA（sgRNA）和Cas9酶進(jìn)行基因組編輯。研究人員可以用簡(jiǎn)單、快速和經(jīng)濟(jì)的方法來(lái)產(chǎn)生sgRNAs，因此能夠在培養(yǎng)細(xì)胞、小鼠、斑馬魚(yú)和其他模型系統(tǒng)中進(jìn)行靶向誘變。為了靶向效率，預(yù)先篩選sgRNAs，對(duì)于成功誘變和減少動(dòng)物飼養(yǎng)成本，都是可取的。八月七日在國(guó)際學(xué)術(shù)期刊《Nucleic Acids Research》發(fā)表的一項(xiàng)研究中，來(lái)自美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院的研究人員，提出了一種簡(jiǎn)單、快速和具有成本效益的熒光PCR為基礎(chǔ)的方法——CRISPR Somatic Tissue Activity Test (CRISPR-STAT)，來(lái)確定sgRNA的靶向特異性效率。

最近，利用鋅指核酸酶（ZFNs）、TAL效應(yīng)物核酸酶（TALENs）和CRISPRs進(jìn)行基因組編輯所取得的進(jìn)展，已經(jīng)使人們有可能在許多系統(tǒng)（包括斑馬魚(yú)）中進(jìn)行靶向誘變。而靶向特異性的ZFNs和TALENs組裝，由于設(shè)計(jì)、成本的限制和/或繁瑣的程序，具有很多局限性，CRISPR/Cas9需要設(shè)計(jì)一個(gè)引導(dǎo)RNA（sgRNA），可以很低的成本快速地合成。

此外，CRISPR/Cas9的靶序列是靈活的，僅僅受到一個(gè)protospacer相鄰基序（PAM位點(diǎn)）的需要的限制。因此，快速設(shè)計(jì)和生成多個(gè)靶標(biāo)的sgRNAs是簡(jiǎn)單的。然而，所有的sgRNAs在產(chǎn)生靶位點(diǎn)突變的時(shí)候，并沒(méi)有表現(xiàn)出類似的活性水平。通過(guò)計(jì)算方法預(yù)測(cè)活性，對(duì)于所有應(yīng)用程序可能是不可靠的，因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)是來(lái)自于有限的、背景特定的數(shù)據(jù)。因此，對(duì)任何給定sgRNA活性水平進(jìn)行快速的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，是必不可少的。

目前，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了許多方法來(lái)評(píng)估靶向核酸酶（包括CRISPR/Cas9）的活性。確定體細(xì)胞活性水平的“金標(biāo)準(zhǔn)”方法，是通過(guò)對(duì)靶區(qū)域進(jìn)行PCR，然后對(duì)大量克隆進(jìn)行測(cè)序。雖然這種方法在確定活性水平方面，具有很高的靈敏度和特異性，但是它是昂貴的，并且是勞動(dòng)密集型的。簡(jiǎn)單的錯(cuò)配試驗(yàn)，如高分辨率熔解分析（HRMA）和DNA裂解（通過(guò)T7核酸內(nèi)切酶），在某些生物（如斑馬魚(yú)）中具有很差的特異性，基因組中具有高頻的多態(tài)性，可造成假陽(yáng)性的結(jié)果。

同樣，限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析受到靶位點(diǎn)選擇的限制。Yu等人開(kāi)發(fā)的基于定量PCR反應(yīng)的程序，是檢測(cè)體細(xì)胞活性的一種可行方法。然而，我們可能很難設(shè)計(jì)與預(yù)測(cè)切割位點(diǎn)重疊的穩(wěn)定引物。最近兩種以序列為基礎(chǔ)的方法——稱為TIDE和CRISPR-GA，被用于細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中sgRNA活性的定量評(píng)價(jià)。然而，這兩種方法都有其應(yīng)用的局限性。目前還沒(méi)有任何一種檢測(cè)，可以很容易地用于所有模型系統(tǒng)。

在這項(xiàng)研究中，研究人員證明了CRISPR-STAT在斑馬魚(yú)中用作預(yù)篩選方法來(lái)評(píng)估sgRNA特異性的效用。通過(guò)將CRISPR-STAT評(píng)估與產(chǎn)生sgRNA的的無(wú)克隆方法相結(jié)合，任何實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該都可以在感興趣的基因中產(chǎn)生突變，并在飼養(yǎng)動(dòng)物之前確證打靶的有效性。研究人員建議，每個(gè)基因應(yīng)該設(shè)計(jì)至少兩個(gè)sgRNA，并評(píng)估一小部分的注射胚胎。這種方法有利于成功的誘變，并最大限度地減少了動(dòng)物飼養(yǎng)和首建動(dòng)物篩選的時(shí)間和成本。

作為原理驗(yàn)證，研究人員在斑馬魚(yú)中檢測(cè)了這種方法，他們用具有已知和不同種系傳遞效率的28個(gè)sgRNA，分析了它們?cè)谧⑸渑咛ブ械捏w細(xì)胞活性。這些數(shù)據(jù)顯示，在注射胚胎的熒光PCR分析結(jié)果和種系傳遞效率之間，存在著強(qiáng)烈的正相關(guān)性。此外，這種方法非常敏感，足以評(píng)估多個(gè)基因打靶。雖然，該研究是利用CRISPR/Cas9和斑馬魚(yú)測(cè)試了這種方法，但是它也可以應(yīng)用于其他動(dòng)物模型系統(tǒng)，以及其他基因組靶向核酸酶。