來(lái)自吉林大學(xué)的研究人員報(bào)告稱，他們利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)高效構(gòu)建出了myostatin (MSTN)基因突變豬。這一研究成果發(fā)布在11月13日的《Scientific Reports》雜志上。吉林大學(xué)的逄大欣(Daxin Pang)教授及焦虎平（Huping Jiao）是這篇論文的共同通訊作者。

開(kāi)發(fā)定制核酸內(nèi)切酶技術(shù)可推動(dòng)構(gòu)建出轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，利用它們來(lái)探究基因功能及生成人類遺傳疾病模型。ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9可在特異位點(diǎn)導(dǎo)入DNA雙鏈斷裂，然后通過(guò)非同源末端連接(NHEJ)或同源重組來(lái)進(jìn)行修復(fù)。通常，NHEJ修復(fù)過(guò)程可在雙鏈斷裂區(qū)域造成小刪除或插入基因突變。由于高效且具備快速裝配能力，在這三種核酸內(nèi)切酶技術(shù)中CRISPR/Cas9成為一種更強(qiáng)大的工具。當(dāng)前，研究人員利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)已成功構(gòu)建出了斑馬魚(yú)、果蠅、小鼠和猴等許多的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。

Myostatin (MSTN)作為TGF-β超家族的一員，在肌肉生長(zhǎng)中發(fā)揮負(fù)調(diào)控因子作用，其為改善家畜生長(zhǎng)性能帶來(lái)了巨大的希望。相比野生型小鼠，MSTN基因敲除(KO)小鼠顯示出更結(jié)實(shí)的肌肉群，一些MSTN自然突變的牛品種也顯示更結(jié)實(shí)的肌肉群。以往的一些研究顯示，在進(jìn)化過(guò)程中豬MSTN基因與牛和羊MSTN經(jīng)歷不同的選擇壓力。有可能MSTN在豬中呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式或起不同的作用。豬是世界上最重要的家畜之一，豬肉在中國(guó)的消費(fèi)量尤其大。因此，構(gòu)建出MSTN基因敲除豬對(duì)于調(diào)查其對(duì)肌肉發(fā)育和產(chǎn)肉性能的影響意義重大。

以往的研究報(bào)道稱，通過(guò)將Cas9 mRNA和sgRNA胞質(zhì)注射到受精卵內(nèi)，或利用抗生素選擇的成纖維細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞核移植(SCNT)來(lái)生成基因靶向豬。但這兩種方法都有缺點(diǎn)。共同注射Cas9 mRNA和sgRNA到受精卵中會(huì)生成具有多種表型的嵌合動(dòng)物，且需要耗費(fèi)時(shí)間和成本完成進(jìn)一步的豬繁殖工作。來(lái)自藥物選擇成纖維細(xì)胞的遺傳工程豬往往攜帶著抗生素耐藥基因，它們正日益受到生物安全性關(guān)注。

在這篇新文章中，吉林大學(xué)的研究人員報(bào)告稱他們將豬胚胎成纖維細(xì)胞(PFFs)的轉(zhuǎn)染效率提高了接近90%，由此提高了靶向載體的突變效率。他們還證實(shí)了CRISPR/Cas9系統(tǒng)可在豬胚胎成纖維細(xì)胞MSTN位點(diǎn)誘導(dǎo)NHEJ、長(zhǎng)片段刪除/倒置及同源指導(dǎo)修復(fù)(HDR)。

最后，研究人員通過(guò)體細(xì)胞核移植利用無(wú)選擇標(biāo)記基因的Cas9/gRNA改造的成纖維細(xì)胞生成了基因靶向豬，獲得了了MSTN雙等位基因突變8只克隆小豬。一些小豬顯示明顯的肌間溝及大舌頭，這是雙肌(DM)表型的特征。相比于對(duì)照，突變克隆豬的MSTN蛋白水平下降，他們還對(duì)MSTN的mRNA水平和相關(guān)信號(hào)通路因子進(jìn)行了分析。最后，研究人員仔細(xì)評(píng)估了克隆豬中的脫靶突變。

作者們表示，新研究中所采用的基因編輯平臺(tái)可以高效地生成生物安全性轉(zhuǎn)基因豬。